[发明专利]基于Crispr-cas9技术构建HCMV编码miRNA缺失株的方法及其应用

说明书

本发明提供一种构建重组人巨细胞病毒的方法及其应用。本发明构建重组人巨细胞病毒的方法利用Crispr‑Cas9技术快速、高特异性的构建了HCMV编码miRNA缺失株，所得HCMV编码miRNA缺失株在编码hcmv‑miR‑US33as‑5p部位发生基因突变，而在其他部位序列无改变，可在易感染细胞中传代。本发明还利用构建的HCMV编码miRNA缺失株，证实了IFNAR1是hcmv‑miR‑US33as‑5p的靶标，抑制该miRNA分子的表达可导致宿主细胞IFNAR1的恢复性上调。针对hcmv‑miR‑US33as‑5p的抑制物有作为抗疱疹病毒感染防治候选药物中应用的价值。

技术领域

本发明涉及基于Crispr-cas9技术构建HCMV编码miRNA缺失株的方法及其应用。

背景技术

巨细胞病毒(cytomegalovirus，CMV)属于β疱疹病毒家族，传播方式包括输血传播、母婴传播及性传播等，人群感染率极高。研究发现CMV编码的微小RNA(microRNA,miRNA)可能作为一种非抗原的免疫调节手段，在病毒的潜伏过程中发挥了重要作用。目前，miRBase数据库记录的由病毒编码的miRNA共有230多种，绝大多数为疱疹病毒编码。已鉴定和发现的人巨细胞病毒(human cytomegalovirus,HCMV)编码的成熟miRNA共有26种，鼠巨细胞病毒(murine cytomegalovirus，MCMV)编码的成熟miRNA共有29种。CMV编码的miRNA功能包括：miR-US33-5p靶向宿主表达的STX3(Syntaxin3)蛋白，进而抑制病毒DNA的合成；miR-US25-2-3p靶向一种重要的RNA解旋酶eIF4A1(eukaryotictranslation initiationfactor 4A1)因子，从而抑制CAP依赖途径的翻译；miR-US25-1和miR-US25-2靶向抑制宿主细胞的多个转录因子，同时还可靶向抑制病毒自身IE72和IE65的表达等。虽然这些miRNA在体内感染中的表达时相和是否发挥作用尚不清楚，但这提示表达miRNA来进行非抗原性基因表达调控可能是一种疱疹病毒在维持自身长期潜伏所采用的共同策略。

目前已有研究表明HCMV可在体内终身潜伏的原因在于该病毒采用的多种免疫逃逸方式，特别是对宿主分泌的干扰素功能的抑制。其不仅可干扰宿主针对HCMV的杀灭过程，更可能干扰宿主对其他感染的反应，甚至有流行病学资料指出，HCMV感染者在接种免疫应答后的抗体产生反应与未感染者也存在着一定差别，这可能与HCMV在潜伏中发生的免疫逃逸机制有关。IFN是病毒诱导的细胞因子，在病毒感染后与IFNAR1结合，激活Jak-STAT1信号通路，最终释放ISGs，发挥免疫调节和抗病毒功能。在众多ISGs中，不同的ISG发挥着各自不同的作用来抵抗病毒入侵。如Mx1基因编码GTP代谢蛋白，在细胞抗病毒免疫应答中，拮抗DNA或RNA病毒的复制。BST2是干扰素诱导的抗病毒宿主限制因子，可以直接限制感染细胞初始病毒颗粒的释放，这些病毒颗粒可立即被细胞内吞降解，有效地抑制了病毒的释放复制。ISG20是IFN信号通路下游的关键调节因子，可直接或间接的调控多达100个基因参与抗病毒的免疫调节作用。

以上研究中已发现CMV乃至疱疹病毒编码的miRNA可能在病毒潜伏方面发挥重要的作用，因而研究CMV的miRNA功能非常重要。但简单的通过miRNA的模拟物或抑制物无法长期稳定的对HCMV编码miRNA进行调控。而传统的利用人工染色体(BAC)技术对CMV技术改造病毒面临着更多的困难，例如技术和设备要求高，时间周期长，成功率低等，亟需能快速、高特异性的构建△miRNA-HCMV病毒株的方法。

发明内容

本发明所要解决的技术问题是如何快速、高特异性的构建研究所需的△miRNA-HCMV病毒株(HCMV编码miRNA缺失株)。

为了解决上述技术问题，本发明提供了一种构建重组人巨细胞病毒的方法，包括利用CRISPR/Cas9方法敲除目的人巨细胞病毒中miRNA基因，得到所述miRNA表达量低于所述目的人巨细胞病毒的重组病毒。