[发明专利]一种检测非洲猪瘟病毒的crRNA以及试剂盒

说明书

本发明提供了一种检测非洲猪瘟病毒的crRNA以及试剂盒，属于病毒检测技术领域。本发明中所述crRNA为引导CRISPR‑Cas12a特异性结合非洲猪瘟靶标DNA的crRNA；本发明所述的试剂盒包括所述的靶标DNA、crRNA、CRISPR‑Cas12a、优化后的检测缓冲液，ssDNA探针和RNA酶抑制剂；CRISPR‑Cas12a在crRNA的引导下识别靶标分子非洲猪瘟DNA后，CRISPR‑Cas12a、crRNA和靶标DNA分子结合成复合物切割检测体系内的ssDNA荧光探针，产生大量荧光可被检测。本发明所述试剂盒检测特异性好，灵敏度高，操作简单，耗时短。

技术领域

本发明属于病毒检测技术领域，尤其涉及一种检测非洲猪瘟病毒的crRNA以及试剂盒。

背景技术

非洲猪瘟(African Swine fever，ASF)，是一种急性，发热传染性很高的病毒所引起的猪病，发病过程短，但死亡率高达100％，病猪临床表现为发热，皮肤发绀，淋巴结，肾，胃肠粘膜明显出血。

非洲猪瘟对我国生猪养殖业造成了很大的影响，但是目前尚无法获得由非洲猪瘟病毒(ASFV)引起的非洲猪瘟(ASF)的疫苗，也没有可行的治疗方法，因此加大防疫力度是有效控制温州猪瘟病的关键，而防疫的重中之重是实现非洲猪瘟病毒的快速、可靠检测。

传统的非洲猪瘟检测方法具有操作复杂、需专业技术人员等不足，难以满足非洲猪瘟高效检测的需求。目前，新兴的基因编辑工具CRISPR-Cas12a已被应用于核酸检测，该检测比qPCR和ELISA更快速、易实施。

发明内容

由鉴于此，本发明的目的在于提供一种检测非洲猪瘟病毒的crRNA以及试剂盒，采用CRISPR-Cas12a的方法检测非洲猪瘟病毒，特异性好，灵敏度高，检测限可达10^-18mol/L。

本发明提供了一种检测非洲猪瘟病毒的crRNA，所述crRNA为引导CRISPR-Cas12a特异性结合非洲猪瘟靶标DNA的crRNA。

优选的，所述crRNA的核苷酸序列包括SEQ ID No.1～SEQ ID No.30中的一种。

本发明提供了一种检测非洲猪瘟病毒的试剂盒，包括所述的crRNA、CRISPR-Cas12a和ssDNA荧光探针。

优选的，所述ssDNA荧光探针为核苷酸序列如SEQ ID No.32所示，两端分别连接荧光基团6-FAM及猝灭基团BHQ-1。

优选的，所述crRNA的使用浓度为200～300nmol/L。

优选的，所述CRISPR-Cas12a的使用浓度为150～250nmol/L。

优选的，所述ssDNA荧光探针的使用浓度为150～250nmol/L。

优选的，所述试剂盒中还包括检测缓冲液，所述检测缓冲液以水为溶剂，包括以下浓度组分：15～25mmol/L的Tris-HCL，80～120mmol/L的KCL，4～6mmol/L的MgCl₂，0.8～1.2mmol/L的DTT，4～6％(体积比)甘油和45～55μg/ml的肝素。

优选的，所述ssDNA荧光探针替换为DNA纳米金探针，所述DNA纳米金探针在DNA巯基处修饰纳米金；所述DNA纳米金探针的核苷酸序列如如SEQ ID No.37-39所示。

本发明的有益效果：本发明提供的检测非洲猪瘟病毒的crRNA以及试剂盒，采用CRISPR-Cas12a的方法检测非洲猪瘟病毒，对非洲猪瘟病毒ASFV具有高度特异性，与猪圆环病毒2型(PCV2)、伪狂犬病病毒(PRV)、牛型支原体PG45株无交叉反应，检测灵敏度高，检测极限可达10^-18mol/L。本发明提供的试剂盒操作简单、方便；检测时间短，整个检测过程在1h内完成。