[发明专利]一种基于结构的CRISPR蛋白的优化设计方法

权利要求书

1.一种基于结构的CRISPR蛋白的优化设计方法，其特征在于，从能量角度出发，使用Rosetta来优化Cas9蛋白与DNA有相互作用的重要氨基酸，以增强Cas9对DNA的结合力，从而获得PAM兼容性高或脱靶率低的突变体，记该突变体为yCas9核酸酶，具体步骤为：

第一步：确定对Cas9特性有重要影响的氨基酸位点；

从蛋白质数据库中下载蛋白结构，通过分析和比较蛋白的电子密度图，找出对Cas9的PAM识别或者脱靶作用有重要影响的氨基酸位点；xCas9突变的7个定向进化位点：A262T、R324L、S409I、E480K、E543D、M694I和E1219V，分布在sgRNA-DNA异源双链体的两侧，这7个氨基酸共同作用，拓展了xCas9的PAM识别范围并降低其脱靶效应；因此，选取这7个位点作为Rosetta优化设计的氨基酸位点；

第二步：Relax能量最小化，选出能量最低的结构作为初始结构；

Relax是Rosetta软件里结构预测中的一个模块；在Rosetta力场中，使用该模块通过多次迭代使结构的氨基酸侧链重排，并且在每轮迭代中不断地调整范德华作用力，以能量最小化的方式搜索该结构的局部最优构象；故采用Relax模块对SpCas9结构PDB ID: 4UN3进行多轮迭代，并根据Rosetta的打分函数，选出能量最低的结构作为初始结构；

第三步：Fixbb优化Protein-DNA相互作用界面；

Fixbb是Rosetta软件里蛋白设计中一个模块；该模块可在固定蛋白主链骨架的同时，使侧链自由旋转，寻找其最佳的位置，并设计最适合该位置的氨基酸；

所以，使用Fixbb模块固定第二步中筛选出的初始结构的主链原子，并对第一步中确定的7个氨基酸位点：262、324、409、480、543、694、1219，进行20种氨基酸组合突变设计，使程序输出10000个排列组合；

第四步：去除重复性结果，筛选突变体；

Fixbb模块输出的结果中，有很多重复的结果；此步骤通过对输出的10000个结果进行序列比对，去除重复的结果，把剩余结果按能量从低到高的顺序排列，并从中进行挑选；最终选择分数值低即更接近自然构象的突变体，并将其命名为yCas9核酸酶；

第五步：突变体的表达与验证；

将筛选到的突变体首先进行质粒构造，然后表达与纯化蛋白，最后对蛋白的剪切活性进行检测，以鉴定设计出的突变体的性能；

最终得到的yCas9核酸酶，其氨基酸序列如SEQ ID NO.6所示，是将野生型SpCas9的第409位的氨基酸S、第480位的E、第543位的E、第694位的M和第1219位的E分别突变成了N、K、D、L和T。

2.一种由权利要求1所述优化设计方法得到的SpCas9突变体yCas9核酸酶，该yCas9核酸酶具有和xCas9相当的基因编辑活性：宽泛的PAM识别范围，可识别NGG、NGA、NGT、NGC、GAA和GAT，且在基因编辑时脱靶率低。

3. 一种多核苷酸，其序列为SEQ ID NO.7，可以转录和翻译成如权利要求2所述的yCas9核酸酶。

4.一种表达载体，其含有如权利要求3所述的多核苷酸。

5.一种宿主细胞，用于转化权利要求4所述表达载体。

6.一种如权利要求2所述的yCas9核酸酶的制备方法，具体步骤包括：首先，构建能够编码所述yCas9核酸酶的多核苷酸表达载体；然后，将所述表达载体转化至宿主细胞，筛选并挑出单克隆；最后，将所述单克隆诱导表达，并通过亲和层析从表达产物中分离出所述的yCas9核酸酶。

7.如权利要求2所述的yCas9核酸酶、如权利要求3所述的多核苷酸以及如权利要求4所述的表达载体作为基因组DNA编辑工具的应用，用于基因组DNA片段的编辑，所述应用为非治疗目的。

8.如权利要求7所述的应用，所述的基因组DNA片段的编辑是单点编辑，或者是编辑位点大于等于两个的多点编辑；编辑的手段包括删除、突变、插入、倒位、移位、重复或易位。

9.如权利要求7所述的应用，其中所述编辑工具还包括与靶标DNA片段匹配的引导sgRNA，所述yCas9核酸酶与能够介导它的sgRNA组合，从而对目的基因进行编辑。