[发明专利]一种基于结构的CRISPR蛋白的优化设计方法有效

专利信息
申请号: 202010666107.5 申请日: 2020-07-12
公开(公告)号: CN111893104B 公开(公告)日: 2021-06-04
发明(设计)人: 黄强;薛冬梅;朱海霞;杜文豪 申请(专利权)人: 复旦大学
主分类号: C12N9/22 分类号: C12N9/22;C12N15/55;C12N15/70;C12N1/21;C12N15/113;C12R1/19
代理公司: 上海正旦专利代理有限公司 31200 代理人: 陆飞;陆尤
地址: 200433 *** 国省代码: 上海;31
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摘要:
搜索关键词: 一种 基于 结构 crispr 蛋白 优化 设计 方法
【权利要求书】:

1.一种基于结构的CRISPR蛋白的优化设计方法,其特征在于,从能量角度出发,使用Rosetta来优化Cas9蛋白与DNA有相互作用的重要氨基酸,以增强Cas9对DNA的结合力,从而获得PAM兼容性高或脱靶率低的突变体,记该突变体为yCas9核酸酶,具体步骤为:

第一步:确定对Cas9特性有重要影响的氨基酸位点;

从蛋白质数据库中下载蛋白结构,通过分析和比较蛋白的电子密度图,找出对Cas9的PAM识别或者脱靶作用有重要影响的氨基酸位点;xCas9突变的7个定向进化位点:A262T、R324L、S409I、E480K、E543D、M694I和E1219V,分布在sgRNA-DNA异源双链体的两侧,这7个氨基酸共同作用,拓展了xCas9的PAM识别范围并降低其脱靶效应;因此,选取这7个位点作为Rosetta优化设计的氨基酸位点;

第二步:Relax能量最小化,选出能量最低的结构作为初始结构;

Relax是Rosetta软件里结构预测中的一个模块;在Rosetta力场中,使用该模块通过多次迭代使结构的氨基酸侧链重排,并且在每轮迭代中不断地调整范德华作用力,以能量最小化的方式搜索该结构的局部最优构象;故采用Relax模块对SpCas9结构PDB ID: 4UN3进行多轮迭代,并根据Rosetta的打分函数,选出能量最低的结构作为初始结构;

第三步:Fixbb优化Protein-DNA相互作用界面;

Fixbb是Rosetta软件里蛋白设计中一个模块;该模块可在固定蛋白主链骨架的同时,使侧链自由旋转,寻找其最佳的位置,并设计最适合该位置的氨基酸;

所以,使用Fixbb模块固定第二步中筛选出的初始结构的主链原子,并对第一步中确定的7个氨基酸位点:262、324、409、480、543、694、1219,进行20种氨基酸组合突变设计,使程序输出10000个排列组合;

第四步:去除重复性结果,筛选突变体;

Fixbb模块输出的结果中,有很多重复的结果;此步骤通过对输出的10000个结果进行序列比对,去除重复的结果,把剩余结果按能量从低到高的顺序排列,并从中进行挑选;最终选择分数值低即更接近自然构象的突变体,并将其命名为yCas9核酸酶;

第五步:突变体的表达与验证;

将筛选到的突变体首先进行质粒构造,然后表达与纯化蛋白,最后对蛋白的剪切活性进行检测,以鉴定设计出的突变体的性能;

最终得到的yCas9核酸酶,其氨基酸序列如SEQ ID NO.6所示,是将野生型SpCas9的第409位的氨基酸S、第480位的E、第543位的E、第694位的M和第1219位的E分别突变成了N、K、D、L和T。

2.一种由权利要求1所述优化设计方法得到的SpCas9突变体yCas9核酸酶,该yCas9核酸酶具有和xCas9相当的基因编辑活性:宽泛的PAM识别范围,可识别NGG、NGA、NGT、NGC、GAA和GAT,且在基因编辑时脱靶率低。

3. 一种多核苷酸,其序列为SEQ ID NO.7,可以转录和翻译成如权利要求2所述的yCas9核酸酶。

4.一种表达载体,其含有如权利要求3所述的多核苷酸。

5.一种宿主细胞,用于转化权利要求4所述表达载体。

6.一种如权利要求2所述的yCas9核酸酶的制备方法,具体步骤包括:首先,构建能够编码所述yCas9核酸酶的多核苷酸表达载体;然后,将所述表达载体转化至宿主细胞,筛选并挑出单克隆;最后,将所述单克隆诱导表达,并通过亲和层析从表达产物中分离出所述的yCas9核酸酶。

7.如权利要求2所述的yCas9核酸酶、如权利要求3所述的多核苷酸以及如权利要求4所述的表达载体作为基因组DNA编辑工具的应用,用于基因组DNA片段的编辑,所述应用为非治疗目的。

8.如权利要求7所述的应用,所述的基因组DNA片段的编辑是单点编辑,或者是编辑位点大于等于两个的多点编辑;编辑的手段包括删除、突变、插入、倒位、移位、重复或易位。

9.如权利要求7所述的应用,其中所述编辑工具还包括与靶标DNA片段匹配的引导sgRNA,所述yCas9核酸酶与能够介导它的sgRNA组合,从而对目的基因进行编辑。

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