[发明专利]一种基于结构的CRISPR蛋白的优化设计方法

说明书

本发明属于蛋白质工程技术领域，具体为一种基于结构的CRISPR蛋白的优化设计方法。本发明基于已解析的CRISPR/Cas9蛋白结构，首先通过分析和比较，找出对Cas9某一功能有重要影响的氨基酸位点；然后结合Rosetta优化Cas9的Protein‑DNA相互作用界面，最后设计并获得新型突变体，成功地获得一个突变体yCas9。该突变体具有xCas9相当的剪切活性：宽泛的PAM识别范围，可识别NGG、NGA、NGT、NGC、GAA和GAT，且在基因编辑时脱靶率低。因此，yCas9在功能上可与xCas9并驾齐驱，是一个有潜在应用价值的基因编辑工具，证明本设计方法的有效性和实用性。

技术领域

本发明属于蛋白质工程技术领域，具体涉及基于结构的CRISPR蛋白的优化设计方法，还涉及由该优化设计方法得到的SpCas9的新型突变体，以及作为基因编辑工具的应用。

背景技术

CRISPR是细菌和古细菌中抵抗外源核酸入侵的免疫系统。近年来，已被人们开发成一种特异性切割DNA片段的基因编辑工具^[1]。目前人们最常使用的是II型CRISPR系统中的化脓性链球菌Cas9（SpCas9）^[2]。但是，SpCas9存在PAM（protospacer adjacent motifs）识别范围有限以及基因编辑时易脱靶的问题，从而使其更广泛应用受到限制^[3-5]。因此，只有拓展PAM识别范围和降低脱靶效应，才能使SpCas9技术在基因编辑领域发挥更大的作用。

为了达到以上目标，人们已提出多种研究方法：一种是利用细菌选择系统来筛选设计SpCas9，通过该方法获得了PAM识别范围扩大的VQR、EQR和VRER突变体^[6]。另一种是基于SpCas9结构指导的改造方法，也获得了高保真突变体eSpCas9、SpCas9-HF、HypaCas9和evoCas9^[7、8]。此外，还有人通过PACE定向进化的方法获得了一个SpCas9突变体（xCas9）。该突变体不仅有高特异性，而且PAM识别更加灵活^[9]。虽然，这些方法可以帮助人们获得Cas9的新型突变体，但是这些方法盲目性比较大，且耗时耗力。

随着计算机运算速度的快速增长，很多计算软件被用来辅助蛋白质设计。这个方法不受体系的限制，只要有蛋白质的三维结构，就可以将蛋白结构模型先精细化，再通过模拟自由能方法计算一些物理和化学过程的自由能变化，从而进行蛋白设计与改造。生物分子结构预测和设计的Rosetta软件包（https://www.rosettacommons.org）包含140个应用程序，该软件可进行蛋白质结构从头预测、蛋白质结构设计和蛋白质重设计等^[10、11]。用Rosetta进行蛋白质设计的方法盲目性低，操作更简单，效率更高。

基于上述问题，开发一种利用Rosetta软件的优化设计CRISPR蛋白的方法十分有必要。

发明内容

本发明的第一个目的是提供一种基于结构的CRISPR蛋白的优化设计方法，以获得SpCas9的新型突变体。

本发明的第二个目的是利用本发明方法获得SpCas9的新型突变体（yCas9），为生物学领域提供有应用价值的新型基因编辑工具。

本发明提供的基于结构的CRISPR蛋白的优化设计方法，从能量角度出发，使用Rosetta来优化Cas9蛋白与DNA有相互作用的重要氨基酸，以增强Cas9对DNA的结合力，从而获得PAM兼容性高或脱靶率低的突变体，记该突变体为yCas9。

具体而言，本发明提供基于结构的CRISPR蛋白的优化设计方法，流程如附图1所示，其具体步骤如下。

第一步：确定对Cas9特性有重要影响的氨基酸位点。