[发明专利]一种快速精准确定基因编辑突变情况的方法及其应用

说明书

本发明涉及一种快速精准确定基因编辑突变情况的方法及应用，属于基因检测技术领域。该方法包括以下步骤：1)基于靶标区间设计引物，扩增，构建文库，送高通量测序；2)对测序数据进行质控，去除质量值小于30的序列；去除“N”碱基含量大于10％的序列；3)进行两端拼接获得长序列，对不同样本的数量统计和计数；4)将S3获得的数据与靶标基因组序列比对，获得分析结果。本发明能够快速高效的检测每个样品的基因编辑突变情况，成本低廉，另外，1G的测序数据只需要1‑2分钟即可获得结果，大大提高了分析速度。

【技术领域】

本发明涉及基因检测技术领域，具体涉及一种快速精准确定基因编辑突变情况的方法及其应用。

【背景技术】

基因组编辑技术已经被广泛的应用于基础研究、基因治疗和遗传改良等多个领域。但是在基因编辑完成后需要进行测序分析来获取突变体准确的突变情况和突变类型。而Sanger测序不仅仅价格昂贵，而且通量低，无法通过一次测序结果而获得编辑产物的准确突变类型。而高通量测序不仅测序成本低廉而且已经有相关文章证明其可以实现对基因型的准确鉴定，但是目前使用的基于高通量测序对基因编辑突变的鉴定方法，是将测序的所有reads重新比对回参考基因组，然后再进行突变分析和统计。公开文献“Hi-TOM：aplatform for high-throughput tracking of mutations inducedby CRISPR/Cassystems”(Liu Q等.[J].SCIENCE CHINA Life Sciences,第62卷第1期，第1-7页，2019，01)介绍了目前使用广泛的Hi-TOM高通量突变分析平台，可以大批量的鉴定不同物种的基因突变情况。但是该分析平台存在分析过程较长的缺陷，由于它比对的是比较短的reads，很有可能比对到很多地方，因此有的相似性较高的序列无法比对出精确的结果，1G的测序数据量分析处理过程可能需要超过一个小时或更长，甚至有时候无法获得鉴定结果，并且分析流程和序列设计相对固定，灵活性差，无法满意一些特定的分析需求。

因此，本方法拟开发一套分析流程，可以在短时间内准确的获得大批量鉴定突变体基因编辑情况，并且可以按照不同特定需求设计实验和分析流程。因此，有必要利用高通量测序的优势，开发一种成本低廉、快速而精准的方法，以便运用于确定基因编辑突变的情况。

【发明内容】

针对现有技术的不足，本发明提供了一种确定基因编辑突变情况的方法，基于高通量测序的优势，以达到成本低廉、快速精准的目的。

为解决上述问题，本发明提供了一种快速精准确定基因编辑突变情况的方法，包括以下步骤：

1.基于靶标区间设计引物，扩增，构建文库，送高通量测序；

2.对测序数据进行质控；

3.对质控后的测序数据进行两端reads的拼接，获得长序列；然后使用统计软件或脚本，将序列相同的样本计为一个，对不同样本的数量统计计数；

4.将步骤3中获得的数据与靶标基因组序列比对，识别出不同的碱基序列，获得分析结果，确定基因突变情况。

进一步地，所述步骤1中设计引物扩增时，左右两端测序数据覆盖靶标区间重叠区间大于8bp；

进一步地，所述步骤1中使用PE100或PE250方法测序；所述PE150测序方法是构建100-260bp文库，用所述PE250测序方法时构建100-460bp文库；

进一步地，所述步骤1中所述测序为基于Illumina测序平台，多样品混样测序时，添加不同的barcode序列进行区分。

进一步地，所述步骤2中，所述质控步骤为：去除质量值小于30的reads；去除“N”碱基含量占总reads数量大于10％的reads。

进一步地，所述步骤3可根据获得数据的质控情况，去除统计计数中占总reads数之比小于5％的reads。