[发明专利]一种金钗石斛花的HPLC指纹图谱构建方法

权利要求书

1.金钗石斛花的HPLC指纹图谱构建方法，其特征在于，包括如下步骤：

步骤(1)：供试品溶液的制备：取金钗石斛花粉末0.4g于锥形瓶中，加入甲醇溶液20mL，超声处理120min，冷却至室温，过滤并取滤液于蒸发皿中，在水浴锅上以50℃以下低温蒸干，残渣加甲醇溶液2mL溶解，移至2mL容量瓶中，加甲醇溶液定容，摇匀即得供试品溶液；

步骤(1.1)：对照品溶液的制备：取D-无水葡萄糖对照品适量，精密称定，加甲醇制成每lml含0.2mg的溶液，即得；

步骤(2)：确定色谱条件：采用尺寸250×4.6mm、粒径5μm的Agilent SB-C₁₈色谱柱，流动相：乙腈A-0.1％磷酸水溶液B，检测波长：254nm；流速：0.8mL/min；柱温：30℃；进样量：10uL；流动相梯度洗脱程序的比例按如下设置：0.01～30min，5％-6％A；30～35min，6％-8％A；35～69min，8％-9％A；69～71min，9％-15％A；71～116min，15％-15.5％A；116～118min，15.5％-32％A；118～127min，32％-38％A；127～131min，38％-50％A；131～135min，50％-80％A；135～138min，80％-100％A；

步骤(3)：进行方法学考察；

步骤(4)：指纹图谱建立及分析：按步骤(1)制备多个批次的金钗石斛花的供试品溶液，将各供试品溶液标定为S1、S2……Sn；将各供试品按步骤(2)的色谱条件进行检测，将得到的图谱导入2012版中药色谱指纹图谱相似度评价系统进行分析，建立金钗石斛花的HPLC指纹图谱；

将对照品溶液按步骤(2)的色谱条件进行检测，得到D-无水葡萄糖对照品HPLC图谱；

对12个不同批次黔产金钗石斛花样品的供试品溶液的HPLC图谱进行分析，将峰面积较大、分离度较好的色谱峰进行标定，确定26个主要特征峰作为共有峰，将供试品溶液的HPLC图谱与D-无水葡萄糖对照品HPLC图谱对比，指认其中26号峰为D-无水葡萄糖，12个批次的金钗石斛花样品供试品溶液26个特征峰对应的保留时间分别为：1号保留时间为5.080min，2号保留时间为9.502min，3号保留时间为14.168min，4号保留时间为15.479min，5号保留时间为21.606min，6号保留时间为26.502min，7号保留时间为43.082min，8号保留时间为45.393min，9号保留时间为47.405min，10号保留时间为52.640min，11号保留时间为53.879min，12号保留时间为57.850min，13号保留时间为60.378min，14号保留时间为62.318min，15号保留时间为63.691min，16号保留时间为67.302min，17号保留时间为71.014min，18号保留时间为78.228min，19号保留时间为79.164min，20号保留时间为80.950min，21号保留时间为81.867min，22号保留时间为91.847min，23号保留时间为94.598min，24号保留时间为97.585min，25号保留时间为126.604min，26号保留时间为132.731min。

2.根据权利要求1所述的金钗石斛花的HPLC指纹图谱构建方法，其特征在于：所述步骤(3)中，包括精密度考察：精密称定同一样品粉末，按步骤(1)制备供试品溶液，按步骤(2)下色谱条件检测，连续进样6次，记录色谱图，以峰型较好，峰面积较大的23号色谱峰为内参比峰，计算共有峰的相对峰面积及相对保留时间的标准偏差值RSD应为0.00％～2.62％和0.00％～0.90％。

3.根据权利要求2所述的金钗石斛花的HPLC指纹图谱构建方法，其特征在于：所述步骤(3)中，包括稳定性考察：精密称定同一样品粉末，按步骤(1)制备供试品溶液，按步骤(3)下色谱条件检测，分别在0h、4h、8h、12h、24h、48h进样，记录色谱图，以峰型较好，峰面积较大的色谱峰为内参比峰，计算共有峰的相对峰面积及相对保留时间的标准偏差值RSD应为0.00％～2.69％和0.00％～0.90％。

4.根据权利要求3所述的金钗石斛花的HPLC指纹图谱构建方法，其特征在于：所述步骤(3)中，包括样品重复性考察：精密称定同一样品粉末6份，按步骤(1)制备供试品溶液，按步骤(2)下色谱条件检测，记录色谱图，以峰型较好，峰面积较大的色谱峰为内参比峰，计算共有峰的相对峰面积及相对保留时间的标准偏差值RSD应为0.00％～2.95％和0.00％～0.47％。