[发明专利]人EGFR基因突变的数字PCR检测方法及应用

说明书

本发明提供了一种人EGFR基因突变的数字PCR检测方法及应用。具体地，提供了优选的针对EGFR S768、EGFR L861和EGFR G719所在序列的引物对、扩增方法、核酸探针以及检测体系，进一步还提供了用于检测EGFR基因突变的试剂盒。本发明通过优化的引物对和探针以及相应反应条件，从而可以对不同样本高灵敏度、强特异性地检测EGFR基因突变。

技术领域

本发明涉及基因检测领域，具体地，涉及人EGFR基因突变的数字PCR检测方法及应用。

背景技术

对于发生EGFR突变的晚期非小细胞肺癌患者，应用表皮生长因子受体-酪氨酸抑制剂(EGFR-TKIs)类靶向药物治疗非常有效，例如吉非替尼(gefitinib)、厄洛替尼(erlotinib)、阿法特罗(afatinib)、达沙替尼(dasatinib)和奥希替尼(osimertinib)。

EGFR突变，尤其是19号外显子缺失、21号外显子(L858R，L861)、18号外显子(G719X，G719)和20号外显子(S768I)突变，与EGFR类酪氨酸激酶抑制剂敏感性高度相关。因此，检测EGFR基因是否突变成为肺癌病人是否使用EGFR靶向药物的前提条件。

19外显子缺失和L858R突变为常见突变，针对这两种突变的肺癌患者，一代EGFR抑制剂吉非替尼，厄洛替尼和二代EGFR抑制剂阿法替尼可以被推荐用于一线治疗。国产药埃克替尼也在CSCO指南中推荐用于一线治疗。

19外显子缺失和L858R突变之外的称之为罕见突变，如L861Q，G719X，S768I等，这些突变位点适合使用第二代靶向药物阿法替尼。

因此，检测EGFR基因罕见突变S768I、L861Q、G719X(包括G719S、G719C、G719A)可供医生在非小细胞肺癌患者中选择靶向药物治疗提供参考，是EGFR常见突变检测的重要补充。

然而，在实际检测EGFR基因罕见突变的过程中，仍然面临着检测样本质量等问题。尽管肿瘤组织和肿瘤细胞学样本是突变检测的最佳样本，但此类样本获取难度大。检测血浆中的游离核酸(Circulating free DNA,简称“cfDNA”),又称“液体活检”，避免了需要肿瘤组织的活检，在临床上是一种非常有用的诊断应用。使用液体活检提供了重复采血的可能性，从而允许在肿瘤发生过程中或者癌症治疗期间追踪cfDNA的变化，进而监控病情变化。

然而，采用无细胞的核酸(如cfDNA)作为肿瘤患者中的生物标志物存在一定难度，尤其是应用cfDNA检测准确并特异地检测基因突变目前存在巨大的技术挑战。首先，血液中的cfDNA含量因人而异，而且大部分情况都非常低,而其中肿瘤来源的游离核酸(Circulating tumor DNA,简称“ctDNA”)的质量更是参差不齐、含量高低不一。

不仅如此，cfDNA检测方法特异性有待提高。Douillard等人报道，使用血浆检测EGFR突变与肿瘤组织检测结果的符合度仅为65％。

此外，目前虽然有一些基于cfDNA来检测EGFR罕见基因突变的方法，但是这些方法的灵敏度和特异性尚难以令人满意。

因此，本领域迫切需要开发基于cfDNA的高灵敏度和高特异性检测EGFR基因突变的方法。

发明内容

本发明的目的在于提供一种基于cfDNA的高灵敏度和高特异性检测EGFR基因突变的方法。

在本发明的第一方面，提供了一种用于检测基因突变的试剂，所述试剂选自下组：

(a)用于检测EGFR S768突变的第一引物对，其中第一引物对包括SEQ ID No:1和2所示的引物；

(b)用于检测EGFR L861突变的第二引物对，其中第二引物对包括SEQ ID No:5和6所示的引物；