[发明专利]一种木瓜样蛋白酶的抑制剂筛选试剂盒及其应用

说明书

一种SARS‑Cov‑2木瓜样蛋白酶抑制剂筛选试剂盒及其筛选方法。本发明提供了一种可用于SARS‑Cov‑2木瓜样蛋白酶的抑制剂筛选方法。该试剂盒包括：SARS‑Cov‑2木瓜样蛋白酶、底物肽Dabcyl‑FTLKGGAPTKVT‑E(Edans)、硼酸硼砂缓冲液。该底物肽在SARS‑Cov‑2木瓜样蛋白酶作用下，荧光团猝灭得以解除，利用反应前后荧光性质的差异实现对SARS‑Cov‑2木瓜样蛋白酶的活性检测，并且该方法可以用于简单方便，特异性好的高通量抑制剂快速筛选。

技术领域

本发明涉及药物筛选领域，具体涉及一种SARS-Cov-2木瓜样蛋白酶的抑制剂筛选方法。

背景技术

目前尚未发现临床批准的针对COVID-19的疫苗和药物，针对 COVID-19研究的技术攻关和药物、疫苗开发仍迫在眉睫。

SARS-Cov-2木瓜样蛋白酶是2019-2020年全球大流行的新冠病毒 covid-19蛋白水解酶，在病毒复制过程中起重要的作用，因此也是抗病毒药研究的重要靶点。筛选该酶的抑制剂，对于寻找该病毒的特效药大有帮助。

目前使用的木瓜样蛋白酶的检测方法，大多是以Z-RLRGG-AMC/ RLRGG-AMC为底物的，该方法是沿用2003年SARS,2013年MERS的木瓜样蛋白酶的检测方法。使用该方法去检测2020年的covid-19是不准确的，可能会导致抑制剂的错筛和漏筛。因此，迫切需要更先进更科学的抑制剂筛选方法。

发明内容

本发明的目的在于提供一种操作简单方便，灵敏度高，特异性好，能够快速筛选SARS-Cov-2木瓜样蛋白酶抑制剂的试剂盒方法。为达到以上目的，本发明采用如下技术方案：

本发明提供一种试剂盒，包括如下组分：

SARS-Cov-2木瓜样蛋白酶、

底物肽Dabcyl-FTLKGGAPTKVT-E(Edans)溶液、

硼酸硼砂缓冲液。

优选地，所述SARS-Cov-2木瓜样蛋白酶其蛋白酶(YP_009725299.1), 购自SinoBiologica(Catalog Number:40593-V-07E),序列为 Glu1564-Val1880，分子量为36.79kDa；其纯度经SDS-PAGE检测92％,浓度为0.1-1毫克/毫升；

优选地，所述底物肽Dabcyl-FTLKGGAPTKVT-E(Edans)溶于二甲亚砜中，其浓度为0.1mM-10mM，其中Dabcyl是猝灭剂4-二甲胺偶氮苯4’-羧酸，Edans是荧光团5-(2-氨基乙氨基)-1-萘磺酸；

优选地，所述硼酸硼砂缓冲液的浓度为10-100毫摩尔每升；所述硼酸硼砂缓冲液的PH为7-9。

使用该试剂盒筛选SARS-Cov2木瓜样蛋白酶的抑制剂，其方法为：

(1)SARS-Cov2木瓜样蛋白酶和底物肽储液均保存于-60到-100℃冰箱中；

(2)将SARS-Cov2木瓜样蛋白酶在冻存板(-4至4℃，优选0至4℃) 里或冰(-4至4℃，优选0至4℃)上室温下融化，取0.1-2uL稀释于97-98uL 硼酸硼砂缓冲液中，加入检测板中；

(3)将0.1mM-10mM抑制剂储液0.1-2uL加入步骤(2)获得的溶液中，微震荡沉静10-30分钟；

(4)将底物肽0.1-2uL加入上述步骤(3)获得的溶液中，使用荧光酶标仪37摄氏度孵育，并使用荧光酶标仪监测342nm激发，496nm处的荧光发射值，每1-5分钟采一点；

(5)不加抑制剂组的荧光值(重复步骤(1)，(2),(4))，作为对照组。