[发明专利]一种通过水稻微效基因克隆创建新等位变异的方法

说明书

本发明公开了一种通过水稻微效基因克隆创建新等位变异的方法。具体地，从水稻品种珍汕97和密阳46衍生的次级群体中克隆微效粒长QTL qGL1‑34.3，粒长在珍汕97和密阳46等位基因间的差异约为0.021mm。采用CRISPR/Cas9基因编辑技术对qGL1‑34.3进行定向编辑，获得的新等位基因与野生型之间的粒长差异约为0.095mm，成功在微效基因座位上创建具有较大效应的等位变异。本发明为新等位变异创建提供新方法，有助于拓宽栽培稻的遗传变异，进而为水稻品种改良提供技术基础。

技术领域

本发明涉及植物基因工程技术领域，具体涉及到一种通过微效基因克隆创建新等位变异的方法，即水稻粒长微效基因qGL1-34.3的克隆以及应用基因编辑技术创建该微效基因的新等位变异。

背景技术

水稻是最重要的粮食作物之一，全球有近一半以上的人口以水稻为主食。我国是水稻生产和消费大国，培育优良的水稻新品种是保证国家粮食安全的重要基础。

水稻品种的改良基于遗传变异，但在水稻长期驯化和品种改良过程中，无论是从野生稻到栽培稻，还是从地方品种到现代改良品种，由于人工选择，遗传多样性持续下降，仅保留了小部分遗传变异。该现象可能正是近年来水稻产量提高遇到瓶颈的原因之一。因此，拓宽遗传变异对水稻品种改良具有重要意义，它包含两种基本途径：外源基因导入和新等位变异创制。对于栽培稻，导入野生稻中的有利等位基因可有效拓宽其遗传变异。在抗病虫等质量性状改良中已取得显著成效，但在产量性状的改良过程中，由于野生稻本身表现不佳以及数量性状由多基因控制的原因进展缓慢。

传统的新等位变异创制主要是指诱变育种，即通过物理、化学或生物学手段诱发生物体发生突变，通过筛选有利变异获得新的品种资源，它在新种质创制和新品种选育中都取得显著成效。但传统的诱变方法引起的突变存在随机性，有利变异需在大规模的群体中筛选，效率较低。

新兴的基因编辑技术可以定向编辑目的基因，改良目标性状，为新等位变异创制提供了一种有效手段。应用基因编辑技术，首先要明确控制目标性状的目的基因。目前，应用数量性状基因(Quantitative Trait Locus，QTL)定位方法已在水稻中克隆31个与产量相关的QTL，其中，控制粒重和粒型的最多，共有17个。这些QTL都呈现出主效作用，但从基因组分布、以及初定位区间看占比太低，限制了基因组编辑技术在拓宽栽培稻遗传变异中的应用。相比主效QTL，微效QTL同样在水稻重要农艺性状调控中扮演着重要角色，无论是机理剖析、还是育种应用，这类QTL都不容忽视。而且，前人研究表明微效QTL在基因组中的比重远超主效QTL。因此，如能成功克隆微效QTL，并应用基因编辑技术创制新的等位变异将对拓宽栽培稻遗传变异大有裨益。

基于此背景，发明人建立了一种通过微效基因克隆创建新等位变异的技术途径。

发明内容

本发明提供了一种通过微效基因克隆创建新等位变异的方法，具体表现为水稻粒长微效QTL qGL1-34.3的克隆，以及在功能验证的同时创建新的等位变异。

通过微效基因克隆创建新等位变异的方法，其特征在于：(1)应用剩余杂合体策略构建近等基因系群体；(2)精细定位微效基因至仅包少数几个候选基因的区间内；(3)应用基因编辑技术定向突变候选基因，功能验证的同时获得新的等位变异。

该方法的详细步骤如下：

(1)筛选杂合区间覆盖目标基因所在区间的剩余杂合体单株，自交后发展F₂群体；

(2)从F₂群体中筛选杂合区间呈连续交叠排列的、新的剩余杂合体单株，分别自交发展F₂群体；

(3)从各F₂群体中筛选杂合区间内分别呈双亲纯合型单株，自交后获得分离区间呈连续交叠排列的近等基因系群体；