[发明专利]一种固定化重组酯酶及其制备R-2,6-二甲基苯基氨基丙酸的应用

权利要求书

1.一种连续批量制备R-2,6-二甲基苯基氨基丙酸的方法，其特征在于所述方法：以(R,S)-N-(2,6-二甲基苯基)氨基丙酸甲酯为底物，以固定化重组酯酶为催化剂，采用填充床反应器进行；所述填充床反应器包括带保温夹套的底物槽，磁力搅拌转子，pH恒定仪，碱液罐，带保温夹套的填充柱，恒温水浴锅，蠕动泵；所述底物槽侧面设有出液口，内部放置磁力搅拌转子，所述出液口通过设有蠕动泵和流量计的管路与填充柱的底部连接，所述填充柱的顶部通过设有取样口的管路与底物罐连通形成循环；同时，pH恒定仪与碱液罐连接后各自与底物罐连通；所述底物罐和填充柱的保温夹套分别与恒温水浴锅连接，所述保温夹套中的水与水浴锅形成循环；

将固定化重组酯酶装入填充柱，将含(R,S)-N-(2,6-二甲基苯基)氨基丙酸甲酯的0.2M、pH 7.0的PB缓冲液作为反应液加入底物槽内，恒温水浴锅温度为20-40℃，开启磁力搅拌，通过pH恒定仪流加碱液罐中的1M NaOH水溶液调节底物罐中pH至7.0；开启蠕动泵，将底物罐中的反应液以0.2-1mL/min的流速通过连接管从填充柱的底部通过填充柱并进入底物罐中进行循环反应，反应液在填充柱内连续循环反应30-720min，反应结束后，反应液分离纯化，获得R-2,6-二甲基苯基氨基丙酸；

所述固定化重组酯酶按如下方法制备：将重组酯酶与大孔树脂按质量比0.02：1的比例混合，在35℃、200rpm的水浴摇床中吸附4个小时后，加入质量浓度50％聚乙烯亚胺水溶液，在35℃、200rpm共价交联1小时后，抽滤除去未吸附酶液，滤饼用超纯水清洗，再次抽滤除去表面水分，再次抽滤的滤饼在45℃下真空干燥，得到固定化重组酯酶；所述聚乙烯亚胺与大孔树脂质量比为0.21:1；所述重组酯酶基因核苷酸序列为SEQ ID NO.1所示；所述大孔树脂的型号包括D3520，XAD1180N，H103，HAD7HP，NKA，DM11，D101。

2.如权利要求1所述方法，其特征在于所述重组酯酶按如下方法制备：将含重组酯酶基因的工程菌接种至LB培养基，在37℃、200rpm下培养12h，获得种子液；将种子液以体积浓度2％的接种量接种至LB培养基中，在37℃、180rpm下培养2h至OD值达到0.6-0.8，然后加入终浓度0.048mg/mL的IPTG，在37℃、150rpm下诱导培养10h后，获得发酵液；将发酵液超声破碎，离心，取上清液上样镍柱，以含0-500mM咪唑的50mM、pH 8.0的Tris-Hcl缓冲液为洗脱液进行梯度洗脱，收集150mM咪唑的洗脱液，利用超滤管在4500rpm转速下离心除盐并浓缩，获得重组酯酶；所述超声破碎条件为：200W，超声1s，停3s，时间为10min。

3.如权利要求1所述方法，其特征在于所述填充柱内固定化重组酯酶装填量为0.236g/cm³。

4.如权利要求1所述方法，其特征在于所述底物浓度为0.5-2.0mol/L。