[发明专利]一种固定化重组酯酶及其制备R-2,6-二甲基苯基氨基丙酸的应用

说明书

本发明公开了一种固定化重组酯酶及其制备R‑2,6‑二甲基苯基氨基丙酸的应用，本发明固定化重组酯酶PAE07具有优异的对映选择性(e.e._p98％)，高酶活，而且比较稳定，对(R,S)‑N‑(2,6‑二甲基苯基)氨基丙酸甲酯的耐受性好。可以在高底物浓度大于1mol/L的条件下进行催化在线制备R‑2,6‑二甲基苯基氨基丙酸，在最佳条件下具有48.5％的转化率，产物的e.e._p为99％，反应时间为480min，相对于其他催化(R,S)‑N‑(2,6‑二甲基苯基)氨基丙酸甲酯的酶催化效率更高，底物浓度可提高3倍以上，而且可以进行重复循环利用，可大大的节省反应成本，适合工业化生产。

(一)技术领域

本发明涉及一种重组酯酶及制备R-2,6-二甲基苯基氨基丙酸的方法。

(二)背景技术

甲霜灵化学名称D,L-N-(2,6-二甲基苯基)-N-(2-甲氧基乙酰)丙氨酸甲酯，俗称保 种灵、瑞毒霉等。甲霜灵是一种对霜霉病菌、疫霉病菌和腐病菌有生物活性的酰胺类 农用杀菌剂，杀菌机理主要是通过抑制病菌体内蛋白的合成，使菌体营养不足，不能 支持其正常生长。甲霜灵具有S型和R型两种异构体，而市面上销售的甲霜灵往往都 为外消旋体。药理研究表面，起到杀菌作用的主要是R型的异构体，R型的异构体作 用比S型高20-30倍，有时甚至是100倍。而且混用，S型会对R型有抑制作用，所 以制备纯度高的R型异构体，可以减少用量，降低成本。

R型的甲霜灵为精甲霜灵，精甲霜灵的合成主要以化学方法为主，以2，6二甲 基苯胺或S-乳酸为原料。但是化学法反应速度比较慢，而且需要高温，高压，副产物 比较多。得到高纯度的中间体(D)-(-)N-2,6-二甲苯基)氨基丙酸甲酯((R)-DMPM)是合成 左旋甲霜灵的关键，目前广泛应用的化学合成法并不能达到精甲霜灵产品的国际标 准。而生物酶具有良好的底物特异性，可以利用生物酶法来进行手性拆分，得到高纯 度的R-2,6-二甲基苯基氨基丙酸。有研究报道商品脂肪酶PS酶被用来拆分中间体 (R,S)-DMPM，得到e.e._p值大于98％的(R)-DMPM。但是PS酶很昂贵，反应时间比较 长，因此需要发展更绿色，有效，具有更高选择性的新型催化剂来拆分(R,S)-N-(2,6- 二甲基苯基)氨基丙酸甲酯。

脂肪酶固定化方法大致上有吸附法、共价结合法、包埋法和交联法四种。但是 因为脂肪酶具有的特有结构性质，对脂肪酶进行固定化时，我们常常选择表面具有 一定疏水性的载体。为了追求更高效的固定化方法，经常把常规的几种固定化方法 结合起来，比如吸附-交联法、包埋-交联法等，这些方法的结合有利于弥补单一方法 的缺点，使固定化方法更加高效。

填充床反应器(Packed Bed Reactor PBR)就是将固定化酶或固定化细胞装填于柱 式反应器内部，形成反应的床层，使流动反应液通过酶床层而催化反应。理想的填充 床假设反应液以平稳，等速不受干扰的通过反应床层，流动模型符合活塞流流动模型。 在连续稳态操作条件下，反应器同一截面上的物料的组成不随时间发生变化，但是随 物料的流动方向位置不同而不同，反应随空间位置而变化。填充床反应器的操作模式 可以分为连续和半连续反应。填充床反应器已广泛运用于固定化酶/细胞催化反应， 包括生物柴油生产，污水处理，生产农药，异构化生产果葡糖浆等。

与其他常规的化学反应器相比，填充床反应器的反应效率比较高，而且易操作，结构简单，对酶的损害比较小，单位体积反应床的酶密度大；反应物的配比，反应的 时间，温度，流速和接触时间等反应条件容易控制；需要的反应物的用量比较大，可 以大产量的得到反应产物，反应过程中也方便进行检测，是一种适合工业化生产物质 的技术。

目前，有较多的国内外学者对酶法手性拆分(R,S)-N-(2,6-二甲基苯基)氨基丙酸甲 酯制备高纯度的R-2,6-二甲基苯基氨基丙酸进行了研究，有商业脂肪酶PS酶，洋葱 伯克霍尔德氏菌的脂肪酶，白色杆菌的脂肪酶等。这些酶反应往往需要时间较长，反 应的转化率和酶的选择性不太高，而且底物的耐受性也不太好。