[发明专利]高效分离培养乳鼠心肌细胞和心肌成纤维细胞的方法

权利要求书

1.高效分离培养乳鼠心肌细胞及心肌成纤维细胞的方法，其特征在于，包括以下步骤：

a、取乳鼠心脏，置于含Blebbistatin的PBS溶液中清洗后，转移至含胰蛋白酶的分离液中，剪碎心脏成小的组织块；

b、将步骤a所述组织块在10～15ml分离液中消化，2～8℃消化4～12小时后，吸走上清，剩余物中加入消化液，在37℃下消化20～30min；

c、步骤b消化完成后，采用移液管吹打混匀，静置，转移上部悬浮液，对静置后下部的组织块再加入消化液，在37℃下消化20～30min，直至无肉眼可见组织块；

d、将步骤c消化后得到的悬浮液混合，离心，弃上清，采用铺板培养基重悬细胞，孵育30～60min，成纤维细胞铺于相应孔板中，上清中的细胞即为心肌细胞。

2.根据权利要求1所述的高效分离培养乳鼠心肌细胞及心肌成纤维细胞的方法，其特征在于：步骤a所述的Blebbistatin为购自MedChemExpress公司的货号为HY-13813的产品，浓度为3～5uM。

3.根据权利要求1所述的高效分离培养乳鼠心肌细胞及心肌成纤维细胞的方法，其特征在于：步骤a所述的分离液组成包括：3～5uM Blebbistatin，0.25％胰蛋白酶，不含钙镁的HBSS缓冲液。

4.根据权利要求1所述的高效分离培养乳鼠心肌细胞及心肌成纤维细胞的方法，其特征在于：步骤a所述的乳鼠为大鼠或小鼠，组织块大小为0.5～1mm³。

5.根据权利要求1所述的高效分离培养乳鼠心肌细胞及心肌成纤维细胞的方法，其特征在于：步骤b、c所述的消化液组成包括：3～5uM Blebbistatin，1～1.5mg/ml II型胶原酶，L15培养基。

6.根据权利要求1所述的高效分离培养乳鼠心肌细胞及心肌成纤维细胞的方法，其特征在于：步骤b、c所述消化的具体操作过程为：在水浴37℃条件下，2～3min内将组织块与消化液摇匀，之后置于旋转混匀器中旋转摇晃消化，旋转转速为10～20rpm，倾斜角度10～15°。

7.根据权利要求1所述的高效分离培养乳鼠心肌细胞及心肌成纤维细胞的方法，其特征在于：步骤b、c所述消化液加入量为5～10ml。

8.根据权利要求1所述的高效分离培养乳鼠心肌细胞及心肌成纤维细胞的方法，其特征在于：步骤d所述离心为200～300g，离心3～5min。

9.根据权利要求1所述的高效分离培养乳鼠心肌细胞及心肌成纤维细胞的方法，其特征在于：步骤d所述铺板培养基组成包括：65％DMEM培养基，19％M-199培养基，15％胎牛血清FBS，1％双抗。