[发明专利]高效分离培养乳鼠心肌细胞和心肌成纤维细胞的方法

说明书

本发明属于细胞分离培养技术领域，具体涉及一种高效分离培养乳鼠心肌细胞和心肌成纤维细胞的方法。针对现有大/小鼠乳鼠心肌细胞及心肌成纤维细胞分离效率低、活性差、操作条件不易控制的问题，本发明提供了一种方法，包括以下步骤：a、取乳鼠心脏，清洗后转移至含胰蛋白酶的分离液中，剪碎；b、组织块在分离液中消化后，吸走上清，剩余物中加入消化液，消化；c、移液管吹打混匀，静置，转移上部悬浮液，对下部的组织块再加入消化液消化；d、悬浮液混合，离心，弃上清，重悬细胞，孵育，成纤维细胞和心肌细胞。本方法能够高效分离心肌细胞，得到的心肌细胞活性高，得率高；还能同时获得心肌成纤维细胞，适宜工业化生产。

技术领域

本发明属于细胞分离培养技术领域，具体涉及一种高效分离培养乳鼠心肌细胞和心肌成纤维细胞的方法。

背景技术

心肌细胞和心肌成纤维细胞是心脏生长发育、生理、代谢、病理等研究中的主要研究对象。因此，心肌细胞和心肌成纤维细胞原代培养技术已经广泛应用于心血管疾病基础研究及心血管药物开发等研究中。目前，对大/小鼠乳鼠的心肌细胞和成纤维细胞的分离方法有：1、机械分离法；2、Langendorff离体灌流法；3、酶消化法。其中Langendorff法需要特殊的设备，且操作复杂，多用于大/小鼠成鼠的分离；机械分离法对细胞损伤较大，细胞存活率较低；酶消化操作简单，对细胞伤害较小，细胞得率高，能够更高效地分离和培养大/小鼠乳鼠原代心肌细胞和成纤维细胞。

专利CN104830759A公开了一种大鼠乳鼠心肌细胞的分离方法，该方法采用单纯胰蛋白酶消化分离心肌细胞的方法。胰蛋白酶消化的原理是使细胞间的蛋白质水解，从而使细胞离散。但是胰蛋白酶对细胞的伤害极大，很难控制单次消化时间和吹打细胞的力度，并且胰蛋白酶工作效率与动物种属，组织来源，浓度，温度和工作时间均有关系。单纯胰蛋白酶消化分离心肌细胞的过程中，对任意一个条件控制不到位，都会影响细胞分离效率。因此，单纯胰蛋白酶消化分离的心肌细胞往往活力差，死细胞多，贴壁细胞少，且基本无法观察到心肌细胞搏动。

专利CN105907708A公开了一种原代小鼠或大鼠心肌细胞的分离培养方法，该方法采用质量比为1:1:1:1的I型胶原酶、II型胶原酶、IV型胶原酶和Dispase酶(一种非特异的金属蛋白酶)的复合酶进行4度消化过夜的方法进行分离。此方法可以对心肌组织中不同分型的胶原成分进行特异性消化，有效减少胰蛋白酶对细胞的损伤。但是不使用胰蛋白酶消化会降低消化效率，并且复合酶的配置大大增加了每次细胞分离的成本，不适用于大量原代细胞的分离培养。

专利CN111154715A公开了一种心肌细胞分离培养方法，该方法适用于大/小鼠，采取先用I型胶原酶消化0.5～3小时，再用加入胰蛋白酶吹打10～300次，终止消化后种板培养。此方法较前一种方法降低了消化酶成本，但胰蛋白酶反复吹打对细胞伤害极大。方法中提到的消化时间和吹打次数较为宽泛，并且并未提到消化时间和吹打次数的确定条件，需要使用者多次预实验确定，不利于快速建立实验方法。

发明内容

本发明要解决的技术问题为：现有大/小鼠乳鼠心肌细胞及心肌成纤维细胞分离效率低、活性差、操作条件不易控制的问题。

本发明解决上述技术问题的技术方案为：提供了一种高效分离培养乳鼠心肌细胞及心肌成纤维细胞的方法。该方法包括以下步骤：

a、取乳鼠心脏，置于含Blebbistatin的PBS溶液中清洗后，转移至含胰蛋白酶的分离液中，剪碎心脏成小的组织块；

b、将步骤a所述组织块在10～15ml分离液中消化，2～8℃消化4～12小时后，吸走上清，剩余物中加入消化液，在37℃下消化20～30min；

c、步骤b消化完成后，采用移液管吹打混匀，静置，转移上部悬浮液，对静置后下部的组织块再加入消化液，在37℃下消化20～30min，直至无肉眼可见组织块；