[发明专利]胞质羧肽酶抑制剂及其应用

说明书

本发明涉及胞质羧肽酶抑制剂及其应用。2‑PMPA作为胞质羧肽酶抑制剂的浓度范围为1nM‑100mM；首次开发了CCP家族的高活性抑制剂。与传统M14金属羧肽酶抑制剂相比，2‑PMPA可以高效抑制CCP家族酶的活性；2‑PMPA不仅抑制CCP家族对蛋白质底物，还可以抑制其催化合成多肽和神经肽的活性。通过酶促反应实验确定了2‑PMPA抑制CCP1催化合成多肽的半数抑制浓度(IC₅₀)为0.99μM，且为混合型抑制，其Ki和Ki’分别为0.096μM和0.235μM。2‑PMPA在实验条件下抑制CCP1催化微管蛋白去谷氨酰化的IC₅₀为0.21mM。

技术领域

本发明涉及胞质羧肽酶抑制剂领域，特别是涉及2-(膦酰基甲基)戊二酸(2-PMPA)作为胞质羧肽酶抑制剂的应用。

背景技术

胞质羧肽酶(Cytosolic Carboxypeptidase,CCP)是M14金属羧肽酶的一个亚家族，催化蛋白的翻译后修饰-多聚谷氨酰化的去修饰。多聚谷氨酰化是一种新型的蛋白质翻译后修饰，发生在蛋白质一级结构中谷氨酸的γ－羧基上，通过酰胺键与游离谷氨酸的氨基相连形成支链，支点上的谷氨酸进而与多个谷氨酸以肽键(α－羧基)依次连接，形成长短不一的多聚谷氨酰侧链。多聚谷氨酰化在体内维持动态的平衡，其起始和延长由类微管蛋白酪氨酸连接酶(Tubulin Tyrosin Ligase Like,TTLL)家族的9个成员催化。而胞质羧肽酶的6个家族成员则催化多聚谷氨酰侧链的缩短和消化。

调控多聚谷氨酰化的修饰酶和去修饰酶功能异常时会导致多聚谷氨酰化失衡，从而会引发多种疾病，包括神经退行，视网膜炎症，雄性不育等。例如CCP1突变会导致pcd小鼠(Purkinje cell degeneration，pcd)的浦肯野细胞退变，还会造成新生绵羊四肢瘫痪，最近研究发现婴儿期开始逐渐发生神经退变的人类患者中携带失活的突变CCP1基因。TTLL1的功能缺失导致KIF1A异常靶向所致的囊泡传递受损。TTLL5变异会导致由RPGR(RetinitisPigmentosa GTPase Regulator)低水平谷氨酰化引起的视网膜营养不良。而开发多聚谷氨酰化去修饰酶抑制剂，将为通过干预这一修饰的平衡治疗相应疾病提供可能。根据我们的检索，迄今没有文献报道过针对胞质羧肽酶家族的有效抑制剂。而通用M14金属羧肽酶家族的抑制剂对胞质羧肽酶家族的抑制选择性差，体外实验表明需要至少毫摩尔的浓度(Wu,H.Y.et al.,Astructural and functional analysis of Nna1 in Purkinje celldegeneration(pcd)mice.FASEB J 26,4468–4480,2012)。因此，寻找高效的胞质羧肽酶抑制剂具有重要的研究意义和应用前景。

2-(膦酰甲基)戊烷二酸(2-PMPA)是谷氨酸羧肽酶II(GCPII)的高效抑制剂，但该化合物对其他羧肽酶的活性影响尚未见报道。胞质羧肽酶和谷氨酸羧肽酶II存在很大差异。两者分别属于不同的金属羧肽酶家族:胞质羧肽酶是M14金属羧肽酶的亚家族，而谷氨酸羧肽酶II是M28金属羧肽酶的亚家族；两者的催化机理不同：胞质羧肽酶依赖于一个锌离子，谷氨酸羧肽酶II除了需要两个锌离子外，钙离子和氯离子对其催化活性也是不可或缺的；在功能上胞质羧肽酶催化多聚谷氨酰化的去修饰，而谷氨酸羧肽酶II将大量神经肽N-乙酰天冬氨酰谷氨酸(NAAG)分解为N-乙酰天冬氨酸(NAA)和谷氨酸。

发明内容

本发明首次开发了2-PMPA可以作为胞质羧肽酶家族的高活性抑制剂，为2-PMPA提供一种新用途，同时提供了抑制胞质羧肽酶家族活性的方法。