[发明专利]氧化石墨烯-溶菌酶∕碱性成纤维细胞生长因子复合敷料制备及创面愈合方法

权利要求书

1.氧化石墨烯-溶菌酶/碱性成纤维细胞生长因子复合敷料制备，其特征在于，包括如下步骤：

S1准备A组氧化石墨烯膜：氧化石墨烯膜购买自南京先锋纳米有限公司(货号：100027，CAS号：7440-44-0，参数：尺寸:9x9cm厚度：约25微米)；

S2制备氧化石墨烯-多巴胺膜：

S21在100mL去离子水中加入131.14g tris盐酸溶解，得到的tris溶液中加入多巴胺粉200mg，得到tris-多巴胺溶液，浓度为2mg/mL,pH值为8.5；

S22将S1中的氧化石墨烯膜浸泡在上述溶液中12h后，将混合物转移到振动筛中，在37℃下以100r/min的速度振动；

S3制备B组氧化石墨烯-溶菌酶样品：

先将达托霉素粉溶解于去离子水中，制备10mg/mL的碱性成纤维细胞生长因子水溶液，再将S1中的氧化石墨烯样品，经去离子水仔细清洗，孵育在达托霉素水溶液中，其中孵育温度37℃；震动速度:100r/min；孵化时间,12h；

S4制备C组氧化石墨烯膜-碱性成纤维细胞生长因子：将S2中制备好的氧化石墨烯-多巴胺膜，溶解在10μg/ml的碱性成纤维细胞生长因子溶液中，孵育温度37℃；震动速度:100r/min；孵化时间,12h；

S5制备D组氧化石墨烯-溶菌酶/碱性成纤维细胞生长因子：将氧化石墨烯膜-多巴胺加入到S3和S4步骤中相同浓度的达托霉素+表皮生长因子混合物中，孵育温度37℃；震动速度:100r/min；孵化时间,12h，制备得氧化石墨烯-溶菌酶/碱性成纤维细胞生长因子。

2.氧化石墨烯-溶菌酶/碱性成纤维细胞生长因子复合敷料的创面愈合方法，其特征在于，包括如下步骤：

S1扫描电镜观察材料表面结构：将A组和D组样品进行喷金，并彻底干燥，然后用扫描电镜仪器在真空中观察得到的薄膜，详细地拍摄孔径结构；

S2傅里叶红外光谱观察材料合成成分：将制备的样品在600cm^-1-4000cm^-1波数范围内，通过傅里叶红外光谱测量表征其化学结构；

S3接触角测试仪观察材料亲疏水性：ABCD四组样本被放置水平，每个材料表面均滴1μL去离子水，封闭静置12h，用形成的液滴测量接触角，每个样品测试三次，得到平均角度值；

S4评估材料体外抗菌性：将大肠杆菌(E.coli)和金黄色葡萄球菌(S.aureus)菌体培养、扩增至1×10⁹CFU/mL的密度，再经LB稀释至1×10⁴CFU/mL的密度，提取100mL菌液。采用96孔板，将ABCD每个样本放置3个孔，每孔滴入200μL菌液，孵化24小时，37℃孵化温度。采用分光光度计评估菌液变化，细菌原液标准OD值设为0.7，24h后再次行OD值检测，观察不同材料对细菌原液影响；

S5评估材料体外细胞毒性：原代成纤维细胞来源于正常的新生小鼠，并进一步将细胞传代至第二代和第三代。采用96孔板进行细胞计数及培养，2000个细胞/孔，将每组样品与血管内皮细胞共同培养，每组3孔。第1、3、5、7天依次检测，37℃条件下孵化后加上LB培养基溶液中(150μL/孔)，上述操作一式三份；

S6评估材料促细胞迁移能力：将血管内皮细胞接种于24孔板(2×10⁴/孔)后，使用DMEM培养基培养，使用枪头划出一道划痕，并记录时间为0h，将ABCD四组材料与该细胞进行共培养，用活细胞工作站显微镜进行24小时观察，在单个实验中，每组设置6个重复，使用ImageJ1.48V软件(美国NIH公司)进行具体测量，上述操作一式三份；

S7小鼠创面模型建立及不同材料对创面愈合影响：小鼠的腹腔内注射戊巴比妥钠(1％,70μL/g)麻醉，然后使用打孔器建立全层皮肤缺损模型，缺损面积直径0.6厘米，每个创面滴加细菌溶液(5μL10⁸/毫升)培养大肠杆菌和金黄色葡萄球菌，用75％的酒精对材料进行消毒，用磷酸缓冲盐溶液漂洗彻底去除杂质，然后，在伤口上涂上准备好的薄膜，然后用粘胶毛巾固定，伤后1、3、5、7天拍照更换材料，采用山东贝诺医药生物科技有限公司【国家发明专利号ZL200620082586.1】采购的市售甲壳素敷料(CCD)作为阳性对照；

S8创面愈合计算：比较创面愈合前后创面面积，计算愈合率，采用IPP6.0软件辅助，根据“感兴趣区域”(AOI)功能选择目标创面面积，我们用“大小计数”方法测量像素面积，伤口面积可按伤口愈合率＝(创面面积-愈合一定时间后的创面面积)/创面面积×100％的公式计算；

S9创面蛋白表达：创面使用材料敷贴第7天后用Wester Blot方法检测PCNA及CD31表达。即在小鼠全层创面缺损创面中取样约10mm×10mm的小方块，包括表皮和肉芽组织，并将其立即置于液氮中冷冻，随后裂解提取蛋白。抗CD31抗体(货号：ab28364,品牌：Abcam,生产地：UK)和抗PCNA抗体(货号：ab15497,品牌：Abcam,生产地：UK)均按1:1000稀释，抗tubulin抗体(品牌：Sungene,生产地：China)按1:2000稀释，所有抗体在使用前一晚维持在4℃，将HRP(中国中山生物公司)标记的山羊抗兔二抗1:2000稀释，与样品在25℃孵育1h，在TBST中洗涤5次后，将收获的PDVF膜送化学发光检测(美国Thermal Scientific)；

S10通过Origin软件，采用单因素方差分析和双因素方差分析分别分析两组之间和两组以上的显著性差异，实验数据以均数±标准差表示，P0.05被认为有统计学意义。