[发明专利]利用葡萄糖生产天麻素的重组酿酒酵母及其用途

说明书

本发明公开了利用葡萄糖生产天麻素的重组酿酒酵母及其用途。本发明工程菌株的构建方法包括使受体菌表达来源于蛇根木的UDP‑葡萄糖基转移酶的步骤。本发明的重组酿酒酵母不表达ARO7基因，含有并能够表达天麻素合成途径基因AsUGT^syn、CAR^syn、PPTcg‑1^syn、ubiC^syn，和表达天麻素前体合成增强的基因ppsA、tktA、ARO1、ARO2和ARO4突变体ARO4^K229L基因。本发明通过引入新的糖基转移酶，在食品级酿酒酵母中构建了从葡萄糖合成天麻素代谢通路，通过基因组整合技术及提高前体合成代谢流，实现天麻素在250mL摇瓶发酵产量达2.1g/L，为大规模工业生产奠定了基础，具有重要的经济价值和社会效益。

技术领域

本发明涉及基因工程领域，具体涉及利用葡萄糖生产天麻素的重组酿酒酵母及其用途。

背景技术

天然产物因其对人体健康的多重益处而被广泛地用作营养补充剂、膳食制品和药物。天麻(Gastrodia elata Blume)属兰科多年生草本共生植物，以地下块茎入药，是传统名贵中药材，具有息风止痉、平抑肝阳、祛风通络等功效，用以治疗头晕目眩、肢体麻木、小儿惊风癫痫抽搐等症。天麻素(Gastrodin)，又名4-羟甲基苯基-beta-D-吡喃葡萄糖甙，为天麻的特征组分，具有较好的镇静和安眠作用，对神经衰弱、失眠、头痛症状有明显的缓解作用。除此之外，天麻素还被证实有提高记忆力、抗炎、抗氧化等功效。

天麻素市场需求量巨大，自20世纪八十年代以来，一直在被多家制药公司或企业生产。迄今，天麻素的工业生产主要是通过化学合成和对天麻植株进行萃取。化学合成法从前体开始需要多步反应，且副产物多、反应专一性差，过程中需要使用毒性较强的溴素、红磷等物质，造成严重的三废问题。天麻素在不同品种的天麻中含量都低，平均在0.2-0.4％，致使植物萃取法存在成本高，环境污染及资源浪费等问题。微生物培养一般在封闭的发酵容器中进行，不受外界环境因素的影响，能提供一致的产品组成和产量。随着合成生物学的发展，通过改造微生物来合成植物源天然产物成为解决市场供应问题的突破口。

天麻素具有以下特征：化学名称为4-(hydroxymethyl)phenyl beta-D-glucopyranoside，分子式为C₁₃H₁₈O₇，分子量为286.2778，CAS号为62499-27-8，结构式为：

天麻素是在糖基转移酶的催化作用下，转移UDP-Glucose的葡萄糖基至对羟基苯甲醇的酚羟基而合成。糖基转移酶的活性高低对天麻素的合成效率有至关重要的影响。作为用于治疗和改善人体健康的药物，选择安全的天麻素微生物生产底盘细胞尤为重要。酿酒酵母遗传操作技术成熟，菌体生长迅速，被食品药品监督管理局(FDA)认定的安全的、可食用级别的微生物，适合用作生产食品、医用药物等底盘细胞。属于真核生物，不受噬菌体感染，在工业发酵生产中可规避常见的噬菌体感染引起的倒罐等问题，且后期产品纯化处理简单，不存在一些细菌底盘如大肠杆菌带来的可导致人体热原反应的内毒素污染。目前用于天麻素合成的糖基转移酶稀少，且尚无在酵母中合成天麻素的报道。

发明内容

本发明的目的是提供利用葡萄糖生产天麻素的重组酿酒酵母及其用途。本发明在鉴定了一个新的高效的糖基转移酶基础上，通过基因工程改造酿酒酵母，实现天麻素的从头合成。

第一方面，本发明要求保护一种构建能够生产天麻素的工程菌株的方法，记为方法I。

所述方法I可包括如下步骤(A1)：

(A1)使受体菌表达糖基转移酶AsUGT，所得菌株命名为工程菌1；所述工程菌1为能够生产天麻素的工程菌株。

其中，所述糖基转移酶AsUGT为来源于蛇根木(Rauvolfia serpentina)的UDP-葡萄糖基转移酶。