[发明专利]一种检测人类EGFR基因突变的试剂盒及其方法

权利要求书

1.一种检测人类EGFR基因突变的试剂盒，其特征在于：包括用于人类表皮生长因子受体EGFR基因G719A、G719S、G719C、E746_A750I、E746_A750del(1)、E746_A750del(2)、L747_T751del1、L747_T751del2、E746_A750A、E746_S752A、E746-S752V、E746-S752D、E746_A750del、L747_P753S、L747_S752del、L747_T751S、L747_T751P、L747_A750P1、L747-A750P2、L747_P753Q、L747-T751Q、L747_E749del、T790M、S768I、V769_D770insASV、H773_V774insH、D770_N771insG、L858R、L861Q等29种突变的引物、探针，内控基因引物和探针、外控基因引物和探针。

2.如权利要求1所述一种检测人类EGFR基因突变的试剂盒，其特征在于：所述人类EGFR基因29中突变的引物和探针分为7个引物体系。

3.如权利要求2所述一种检测人类EGFR基因突变的试剂盒，其特征在于：引物体系1包括用于检测G719A、G719S、G719C位点的引物和探针，引物体系2包括用于检测E746_A750I/E746_A750del(1)、E746_A750del(2)/L747_T751del1、L747_T751del2/E746_A750A、E746_S752A/E746-S752V、E746-S752D/E746_A750del、L747_P753S/L747_S752del、L747_T751S/L747_T751P、L747_A750P1/L747-A750P2、L747_P753Q/L747-T751Q、L747_E749del位点的引物和探针，引物体系3包括用于检测T790M位点的引物和探针，引物体系4包括用于检测S768I位点的引物和探针，引物体系5包括用于检测V769_D770insASV、H773_V774insH、D770_N771insG位点的引物和探针，引物体系6包括用于检测L858R位点的引物和探针，引物体系7包括用于检测L861Q位点的引物和探针。

4.如权利要求1-3中任一项所述一种检测人类EGFR基因突变的试剂盒，其特征在于：所述人类EGFR基因29中突变的引物和探针序列如SEQ IQ NO.1-SEQ IQ NO.34所示。

5.如权利要求1所述一种检测人类EGFR基因突变的试剂盒，其特征在于：所述人类EGFR基因外控基因引物和探针序列如SEQ IQ NO.35-SEQ IQ NO.37所示。

6.如权利要求1所述一种检测人类EGFR基因突变的试剂盒，其特征在于：所述人类EGFR基因内控基因引物和探针序列如SEQ IQ NO.38-SEQ IQ NO.40所示。

7.如权利要求1所述一种检测人类EGFR基因突变的试剂盒，其特征在于：所述试剂盒还包括荧光定量PCR反应缓冲液，dNTPs，热启动DNA Polymerase，阴性对照品和阳性对照品。

8.一种根据权利要求1-7中任一项所述检测人类EGFR基因突变的试剂盒的使用方法，其特征在于，包括以下步骤：

1)核酸提取：根据样本类型(外周血/石蜡包埋组织)选择不同的商业化试剂盒进行DNA提取，本发明中外周血DNA提取采用美基生物生产的HiPure Blood DNA Mini Kit试剂盒，石蜡包埋组织DNA提取采用HiPure FFPE DNA Kit试剂盒；

2)PCR反应体系的配置：预混分装荧光定量PCR反应缓冲液，dNTPs，热启动DNAPolymerase形成PCR反应液，然后将步骤1)得到的DNA及引物体系1-7、外控基因引物探针体系分别加入PCR反应液中分别形成PCR反应体系1-PCR反应体系8，共同组成PCR反应体系；混匀后瞬离5s，进行PCR扩增；

3)反应结束后进行基因分型判读。

9.如权利要求8所述一种检测人类EGFR基因突变的试剂盒的使用方法，其特征在于，步骤2)中所述PCR扩增的条件为：

预变性的条件为：95℃，2min；

第一阶段由5个扩增循环构成，其条件为：95℃，15s；58℃，1min；

第二阶段由40个扩增循环构成，其条件为：95℃，15s；60℃，1min，并于60℃分别采集FAM(靶点)、VIC(内参)荧光通道的信号。