[发明专利]一种检测人类EGFR基因突变的试剂盒及其方法

说明书

本发明提供一种检测人类EGFR基因突变的试剂盒，包括用于人类表皮生长因子受体EGFR基因29种突变的引物、探针，内控基因引物和探针、外控基因引物和探针，还包括荧光定量PCR反应缓冲液，dNTPs，热启动DNA Polymerase，阴性对照品和阳性对照品。本发明还提供了一种检测人类EGFR基因突变的试剂盒的使用方法。解决了人类EGFR基因突变检测时在灵敏度、成本、操作方便性等问题。

技术领域

本发明应用于基因检测技术领域，具体涉及一种检测人类EGFR基因突变的试剂盒及其方法。

背景技术

人类表皮生长因子受体(epidermal growth factor receptor,EGFR)存在于所有正常上皮和部分间叶来源的细胞，对细胞的生长、分化调节有着十分重要的作用，该受体基因位于人类7号染色体的短臂上，由大约19K个碱基组成，包含28个外显子。其酪氨酸激酶功能区由外显子18～24编码，其表达产物可激活酪氨酸激酶，从而打开下游信号通路。EGFR主要通过两条途径将信号传递至细胞核，一条是Ras→Raf→MAPK途径；另一条是PI3K→PKC→IKK途径。当信号传导至细胞核后，引起核内基因转录水平的增加，使细胞增殖、转化。

所以EGFR信号传导的异常是导致多种肿瘤发生的原因。EGFR成为肿瘤特别是非小细胞肺癌靶向治疗研究的一个重要靶点，表皮生长因子受体酪氨酸激酶抑制剂(EGFR-TKIs)是针对该靶点的小分子抑制剂，多项临床研究证实，EGFR基因突变的晚期NSCLC患者能从酪氨酸激酶抑制剂显著获益。近年来的大量研究发现EGFR基因的编码区主要是在外显子18～21上会发生突变，突变种类至少30种与EGFR-TKIs的药物反应性有关，其中主要是19外显子上的缺失突变和21外显子上的L858R点突变，其中缺失突变最常见的是del E746-A750，和21外显子替代突变(L858R)被称作经典突变或者热点突变，约占突变的90％。所以EGFR突变是患者是否对此TKI敏感的强预测因子，TKI药物的治疗应当依据EGFR基因检测结果选择治疗对象，筛选最合适的患者进行有针对性的靶向治疗，以提高药物疗效，有效抵制癌症的进展。

目前常用的基因突变检测方法有测序法和ARMS-PCR方法；DNA测序法是进行EGFR突变检测的可靠方法，也是使用最多的方法。测序法需要对测序样品扩增、纯化、序列分析，过程比较繁琐、耗时长，且对取材和技术要求比较高，更重要的是由于测序方法本身的限制灵敏度不高，只能对含量大于30％的突变基因进行检测，对环境和操作者有危害。虽然有专门的测序公司，可以避免操作的限制，缩短成果时间，但是费用昂贵。因此，此方法在临床应用中还存在一定的限制，不适于大量临床样品分析。

发明内容

本发明针对现有技术中存在的人类EGFR基因突变检测时在灵敏度、成本、操作方便性等问题，提供一种检测人类EGFR基因突变的试剂盒及其方法。本试剂盒具有高灵敏度、低成本、操作简便等特点，可以快速精准的对人类EGFR基因突变进行检测，检测灵敏度达到0.5％。

本发明解决其技术问题是采用以下技术方案实现的：

一种检测人类EGFR基因突变的试剂盒，包括用于人类表皮生长因子受体EGFR基因G719A、G719S、G719C、E746_A750I、E746_A750del(1)、E746_A750del(2)、L747_T751del1、L747_T751del 2、E746_A750A、E746_S752A、E746-S752V、E746-S752D、E746_A750del、L747_P753S、L747_S752del、L747_T751S、L747_T751P、L747_A750P1、L747-A750P2、L747_P753Q、L747-T751Q、L747_E749del、T790M、S768I、V769_D770insASV、H773_V774insH、D770_N771insG、L858R、L861Q等29种突变的引物、探针，内控基因引物和探针、外控基因引物和探针。