[发明专利]一种APPV病毒的PCR引物、探针及其鉴别方法

说明书

本发明公开了一种APPV病毒的PCR引物、探针及其鉴别方法，鉴别APPV病毒的微滴数字PCR反应体系为：ddPCRTM Supermix for Probes(no dUTP)、具有如SEQ.ID NO1所示核苷酸序列的上游引物、具有如SEQ.ID NO2所示核苷酸序列的下游引物、具有如SEQ.ID NO3所示核苷酸序列的探针、待检测样品的cDNA和水。本发明的微滴式数字PCR方法能够快速检测，具有良好的特异性，其能检出的最低检测限为0.15copies/μL，灵敏度高，而且组内组间重复试验变异系数均小于6％，具有良好的重复性和稳定性。

技术领域

本发明涉及一种鉴别APPV病毒的方法，具体涉及一种APPV病毒的PCR引物、探针及其鉴别方法。

背景技术

猪非典型瘟病毒(atypical porcine pestivirus，APPV)是黄病毒科、瘟病毒属成员，基因组序列全长约为11-12kb。APPV与同病毒属其他病毒一样，既可以通过垂直传播也可以通过接触传播，大多数4-14周龄的架子猪和1周龄以内的仔猪感染后会出现病毒血症，受感染的公猪也可以通过精液进行病毒传播。该病毒是造成AⅡ型先天性震颤的主要病原之一，初产母猪感染后，所产仔猪大多数呈现肌肉震颤和八字腿的症状。仔猪感染后，症状轻微的表现为耳朵、侧腹或后腿区域出现明显的震颤，严重的则表现为全身性的肌肉震颤、站立或行走困难，因无法喝上初乳，最终大多数感染仔猪死于饥饿，给养猪业带来巨大损失。

随着猪场集约化养殖的不断发展，密集型饲养方式以及猪群的跨区域流通导致猪群之间接触的几率增大，建立快速有效检测疾病的方法显得十分关键。由于分子生物学的不断发展，PCR检测技术因具有操作简便、耗时短、特异性高且结果精确等特点，在日常检测中得到广泛应用。但是，在以往的疾病检测中，使用传统的PCR、qPCR检测方法常出现假阳性、灵敏性低、重复性不高的情况。在病毒感染初期，这两种方法均无法快速、灵敏的对病毒进行检测。

发明内容

本发明的目的是提供一种APPV病毒的PCR引物、探针及其鉴别方法，该方法解决了现有PCR检测灵敏度低的问题，可通过泊松分布公式和阳性单元荧光信号占所有反应单元的比值来计算出样品的原始浓度和含量、快速鉴别APPV病毒，灵敏度高。

为了达到上述目的，本发明提供了一种APPV病毒的PCR引物组，该引物组的上游引物具有如SEQ.ID NO1所示的核苷酸序列，其下游引物具有如SEQ.ID NO2所示的核苷酸序列。

本发明的另一目的是提供一种用于鉴别APPV病毒的探针，该探针具有如SEQ.IDNO3所示的核苷酸序列。

本发明的另一目的是提供一种用于鉴别APPV病毒的微滴式数字PCR方法，该方法采用的微滴数字PCR反应体系为：ddPCRTM Supermix for Probes(no dUTP)、具有如SEQ.IDNO1所示核苷酸序列的上游引物、具有如SEQ.ID NO2所示核苷酸序列的下游引物、具有如SEQ.ID NO3所示核苷酸序列的探针、待检测样品的cDNA和水；若待检测样品有阳性微滴出现荧光信号，则含有APPV病毒。

优选地，该方法采用的微滴数字PCR反应程序为：95℃10min；94℃30s，52.7℃60s，共40个循环；98℃10min。

优选地，所述微滴数字PCR反应体系中，上游引物和下游引物的浓度均为450nM；探针浓度为250nM。

优选地，所述微滴数字PCR反应体系为：ddPCRTM Supermix for Probes(no dUTP)10μL、探针0.5μL、上游引物1μL、下游引物1μL、待检测样品的cDNA2μL，最终补水至终体积20μL。

本发明的APPV病毒的PCR引物、探针及其鉴别方法，解决了现有PCR检测灵敏度低的问题，具有以下优点：