[发明专利]一种快速检测食源性致病菌沙门氏菌用标准化质粒冻干粉

说明书

本发明属于食品检测技术领域，具体涉及一种快速检测食源性致病菌沙门氏菌用标准化质粒冻干粉。具体制备步骤包括：提取沙门氏菌全基因组DNA、设计引物并进行PCR扩增、与pLB质粒连接、转化、筛选、鉴定并提取质粒、制备冻干粉成品等步骤。本申请中，发明人以现有若干菌株作为标准菌株，以invA和fimI毒力基因作为目标基因，利用基因工程技术手段，以pLB质粒作为载体，构建了含有目标毒力基因的标准化质粒样品。利用该标准品，可为相关沙门氏菌的快速检测和鉴定奠定良好技术基础，无论对于沙门氏菌标准化检测体系建立、抑或对于确保食品安全，都具有十分重要的技术价值和应用意义。

技术领域

本发明属于食品检测技术领域，具体涉及一种快速检测食源性致病菌沙门氏菌用标准化质粒冻干粉。

背景技术

随着人们生活水平的不断提高，人们对于食品安全问题日益重视。在食品安全问题中，食源性微生物所导致的食品质量问题一直居于首位，而由食源性微生物所引起的食源性疾病已经成为最重要的世界性卫生疾病问题之一。受限于技术实际和其他客观条件，现阶段我国检测食源性微生物时，即时性检测时，由于定性检验DNA参考物质体系尚不不完整，因此大大限制了检验检测的技术水平。

沙门氏菌(Salmonella)，能够感染水源、食物后引起肠胃炎、腹泻等疾病，严重危害人类身体的健康安全。作为食源性微生物中主要常见致病菌之一，在食品卫生以及流行病学领域，沙门氏菌也是重要的基础性研究对象。对沙门氏菌的基因组研究表明，沙门氏菌侵袭蛋白A基因(invA)编码吸附和侵袭上皮细胞表面蛋白，inv基因簇与沙门氏菌对肠道上皮细胞的侵袭有关，其中invA基因编码的蛋白属于沙门氏菌的主要毒力因子。沙门氏菌菌毛是由fim基因决定簇编码，fim基因操纵子都包含编码结构组分的基因和编码菌毛有序装配装配蛋白的基因，其中fimI基因编码黏附素蛋白。因此，如能开发一种针对致病沙门氏菌毒力基因检测用标准品，对于相关致病菌的即时、快速检测具有十分重要的技术意义。

发明内容

本申请目的在于提供一种检测食源性致病菌沙门氏菌用标准化质粒冻干粉，以此作为标准品应用时，可为沙门氏菌的快速、即时检测体系的建立和食品安全奠定一定技术基础。

本申请所采取的技术方案详述如下。

一种快速检测食源性致病菌沙门氏菌用标准化质粒冻干粉，以鼠伤寒沙门氏菌CMCC 50071、CMCC 50115(中国医学细菌保藏管理中心)、鼠伤寒沙门氏菌ATCC 14028（美国菌种保藏中心）或者肠炎沙门氏菌CICC 21482（中国工业微生物菌种保藏管理中心）这四种菌株为例，以invA（编码侵扰蛋白）基因和fimI（编码黏附素蛋白）基因为目标毒力基因，以pLB质粒作为载体质粒，通过基因工程技术手段，转化制备成含有目标毒力基因的标准品，从而为致病菌标准化检测体系奠定基础，具体步骤如下：

（一）提取沙门氏菌全基因组DNA、设计引物并进行PCR扩增

利用现有细菌基因组DNA提取试剂盒，参考其说明书，提取沙门氏菌全基因组DNA备用；

针对目标毒力基因invA和fimI，分别设计PCR扩增用引物序列如下：

fimI-F：5’- CACTAAATCCGCCGATCAA-3’，

fimI-R：5’- CAACGGTGAGGAGGTATTATC-3’；

invA-F：5’- GTGAAATTATCGCCACGTTCGGGCAA-3’，

invA-R ：5’-TCATCGCACCGTCAAAGGACCC-3’；

以所提取的沙门氏菌全基因组DNA为模板，利用上述引物进行序列扩增；

对PCR扩增产物进行回收、纯化备用；

（二）连接、转化