[发明专利]一种RNA的原位检测方法

权利要求书

1.一种RNA的原位检测方法，其特征在于：

(1)根据目标RNA上的靶序列，每个杂交位点设计至少一对由两条探针组成的靶序列识别探针对；每条探针包括至少三部分：与目标RNA靶序列互补的识别序列、与成环单链DNA互补的成环模板序列以及二者之间的连接寡聚核苷酸序列；其中，每条探针的识别序列在目标RNA靶序列对应的互补位置不重合；互补位置之间间隔0个-5个碱基；每对靶序列识别探针中，一条靶序列识别探针的与目标RNA靶序列互补的识别序列位于探针的3’端；另一条靶序列识别探针的与目标RNA靶序列互补的识别序列位于探针的5’端；

(2)提供可能含有所要检测的目标RNA的细胞或者组织样品；

(3)在样品中加入步骤(1)设计的至少一对靶序列识别探针，使目标识别探针进入步骤(2)所得的细胞或者组织样品内，识别并杂交到待测细胞内的目标RNA上的靶序列，多余的探针通过洗涤去除；

(4)将至少两条不同序列的成环单链DNA分子加入到上述样品中；其中，一条成环单链DNA分子5’端和第一条识别序列的成环模板序列的5’端反向互补，所述互补序列为第一序列，3’端和另一条识别序列的成环模板序列的5’端反向互补，所述互补序列为第二序列；至少另一条成环单链DNA分子的3’端和第一条识别序列的成环模板序列的3’端反向互补，所述互补序列为第三序列，5’端和第一条序列相邻的另一条识别序列的成环模板序列的3’端反向互补，所述互补序列为第四序列；

(5)上述至少两条成环单链DNA分子的首尾两端的序列分别于其在两条靶序列识别探针上的互补序列互补杂交，形成一个带有至少两个刻痕缺口的环状DNA结构；

(6)将上述含有环状DNA结构的样品，加入含有DNA连接酶的反应液，在DNA连接酶的介导下，环状DNA结构连接形成一个完整的环状DNA分子；

(7)上述环状DNA分子通过滚环扩增获得扩增产物；

(8)将带有标记的检测探针与上述滚环扩增产物相结合，洗去多余的检测探针，通过显微镜检测滚环扩增产物的信号，从而实现对RNA的原位检测。

2.如权利要求1所述的RNA的原位检测方法，其特征在于：靶序列识别探针的长度为40-50个碱基，两条成环探针分别为50-60个碱基和15-25个碱基。

3.如权利要求2所述的RNA的原位检测方法，其特征在于：检测探针的序列和较短的成环单链DNA分子上的序列相同。

4.如权利要求1所述的RNA的原位检测方法，其特征在于：第一序列、第二序列、第三序列以及第四序列的长度范围分别为1-15个碱基。

5.如权利要求1所述的RNA的原位检测方法，其特征在于：靶序列杂交位点为1-30个。

6.如权利要求1所述的RNA的原位检测方法，其特征在于：所述目标RNA包括细胞本身的RNA以及外源性基因在细胞内部表达的RNA。

7.如权利要求2所述的RNA的原位检测方法，其特征在于：所述外源性基因在细胞内部表达的RNA包括病毒RNA和质粒RNA。

8.如权利要求1所述的RNA的原位检测方法，其特征在于：所述待测细胞包括人工培养的细胞、血液细胞和组织中的细胞。

9.如权利要求1所述的RNA的原位检测方法，其特征在于：目标RNA靶序列识别探针为含有自然核苷酸或者修饰核苷酸的单链DNA。

10.如权利要求1所述的RNA的原位检测方法，其特征在于：成环单链DNA为含有天然核苷酸或者修饰核苷酸、类核苷酸的单链DNA。