[发明专利]一种RNA的原位检测方法

说明书

本发明公开了一种RNA的原位检测方法。首先，每个杂交位点使用至少两条目标RNA靶序列识别探针与固定的细胞或者组织样本中的目标RNA靶序列进行杂交。接着，利用另外两段单链DNA通过其末端与上述的靶序列识别探针上的互补序列杂交形成一个带有两个刻痕缺口的环状DNA分子。接着，用DNA连接酶将这两段DNA连接成环后，经过滚环扩增得到滚环扩增产物。而未杂交连接的单链DNA无法成环，因此没有扩增产物。滚环扩增产物与标记的检测探针杂交，多余的检测探针通过洗涤除去；在显微镜下可以观测到单个的滚环扩增产物，通过这些滚环扩增产物的存在和数量可以判定目标RNA在细胞和组织中的表达情况。本发明高度整合了核酸探针技术、滚环扩增技术和原位杂交技术，实现细胞和组织中的RNA表达进行高灵敏高特异性地检测。

技术领域

本发明属于RNA水平的基因表达原位检测技术领域，具体涉及一种利用特殊设计的探针识别RNA靶序列，通过滚环扩增进行信号放大以及原位杂交检测RNA表达丰度和位置的分析方法。

背景技术

目前，RNA检测主要依赖于PCR、微阵列和高通量DNA测序技术。尽管这些技术已经成为研究基因表达的金标准，但是由于在使用这些技术之前需要对RNA分子进行提纯，导致了RNA分子空间位置信息的丢失，因而无法将基因表达信息与组织的形态学信息联系在一起。基因表达的形态学信息可以为构建基因表达调控网络提供非常重要的信息，不同基因的表达在空间分布上的高度一致可能意味着这些基因之间有紧密联系。虽然，通过原位杂交(in situ hybridization,ISH)亦可以对RNA分子进行原位分析，然而传统的RNA原位杂交缺乏敏感性，特异性以及复杂的探针制备等使得这个方法在科研和诊断实验室中一直没有广泛的应用。单分子RNA原位检测技术的出现在很大程度上解决了传统RNA原位杂交的局限性，因此受到了越来越广泛的重视。

实现单分子RNA原位检测的关键是获得足够的检测信号。单分子荧光原位杂交技术(single molecule fluorescence in situ hybridization,smFISH)正是基于这样的原理在被检测的RNA单分子上标记尽量多的可检测的信号分子，如荧光标记探针，从而可以检测到单个RNA分子。美国的Advanced Cell Diagnostics公司的RNAScope技术利用分支DNA(branched DNA,bDNA)技术其对信号的放大作用，也可以进行单分子RNA原位检测。该技术通过一对“Z”字形的目标识别探针与单分子RNA杂交并靠近，然后一条一级信号放大探针与这两条“Z”探针杂交结合，紧接着多条二级信号放大探针与一级信号放大探针杂交，最后多条的荧光标记的三级探针再结合到二级探针上面，形成一个树枝分叉状的信号放大体系，最后获得足够强的信号来检测单分子RNA。

另外，采用邻近连接技术也可对单分子RNA进行检测(proximity ligation assayfor RNA，PLAYR)。此方法采用探针对的近端连接来检测靶标分子，探针对直接与单分子RNA杂交，每条探针由10个腺嘌呤碱基组成的连接区分隔开两个功能区，5’端区域与目标RNA结合，3’端区域与后续的成环探针相结合。最终，通过滚环扩增技术获得足够强的信号。但bDNA和PLAYR这两种方法分别有不足的地方。

发明内容

本发明的目的在于提供一种RNA原位检测技术，用于对RNA水平上的基因表达进行定量和定位分析。

本发明的技术方案如下：

一种RNA表达原位检测分析方法，包括如下步骤：

(1)根据目标RNA上的靶序列设计至少一对靶序列识别探针；每条探针包括至少三部分：与目标RNA靶序列互补的识别序列、与成环单链DNA互补的成环模板序列以及二者之间的连接寡聚核苷酸序列；其中，每条探针的识别序列在目标RNA靶序列对应的互补位置不重合，优选地，互补位置之间间隔0个-5个碱基；每对靶序列识别探针中，一条靶序列识别探针的与目标RNA靶序列互补的识别序列位于探针的3’端；另一条靶序列识别探针的与目标RNA靶序列互补的识别序列位于探针的5’端；