[发明专利]提高膜片钳试验时hERG-HEK293细胞稳定性的培养方法

说明书

本发明公开了一种提高膜片钳试验时hERG‑HEK293细胞稳定性的培养方法，属于细胞培养领域。本发明的方法，通过提高培养基中FBS的含量至20％v/v及优化传代消化的操作步骤，能提高hERG‑HEK293细胞在膜片钳试验时的稳定性，进而提高膜片钳试验的成功率。

技术领域

本发明属于细胞培养领域。

背景技术

膜片钳(patch-clamp)试验，是一种检测超微弱pA级电流信号的特殊技术，该技术是将微电极尖端(通常直径＜5μm)部分通过微操作装置接触到细胞膜表面，再通过负压将细胞膜轻轻吸起来，形成相对封闭的区间(即封接)，由于其材质主要是不导电的二氧化硅，在尖端区域会产生电阻达到10⁹Ω以上高阻抗，从而形成一种电学上的保护罩效应使得Na⁺、K⁺、Ca²⁺等离子无法从其它地方通过，只能从管内局部的膜片区域进出，从而能记录下Na⁺、K⁺、Ca²⁺等维系细胞生理起重要作用的离子在通过细胞膜进行内外流动时所产生的超微弱电流。膜片钳试验被誉为研究细胞离子通道的黄金标准，可用于离子通道相关药物的筛选(郭凯，用于生物细胞研究的表面功能化修饰膜片钳微电极，上海交通大学硕士学位论文，2019)。

hERG(人ether-a-go-go相关基因)编码的离子通道称为hERG通道，共有3种亚型：hERG1、hERG2和hERG3，属于电压依赖性钾通道家族。hERG-HEK293细胞，是表达hERG的HEK293细胞，是膜片钳试验筛选离子通道相关药物药效的常用细胞模型。

在进行膜片钳试验时，hERG-HEK293细胞受细胞膜状态影响，容易出现不稳定的情况，具体表现为：细胞膜较脆，电极刚接触细胞，细胞膜即破裂，无法封接。这些不稳定会导致试验失败，影响药物筛选效率。而目前尚未见有关提高膜片钳试验时hERG-HEK293细胞稳定性的方法的报道。

发明内容

本发明要解决的问题是：提供一种提高膜片钳试验时hERG-HEK293细胞稳定性的培养方法。

本发明的技术方案如下：

提高膜片钳试验时hERG-HEK293细胞稳定性的培养方法，包括：

1)使用含FBS(胎牛血清)20％v/v的培养基进行培养；

2)当细胞融合度为80-90％时，对细胞进行传代，传代时，加入有效量消化酶室温下消化20±5秒，倒掉消化酶，再将装细胞的培养瓶放入37℃培养箱孵育2±0.5分钟，使细胞从贴壁状态转为游离状态；再加入培养基终止消化。

如前述的方法，步骤1)的FBS含量为20％v/v。

如前述的方法，所述培养基使用前均在37摄氏度下预热。

如前述的方法，所述培养基是DMEM高糖培养基。

如前述的方法，所述消化酶是TrypLETMExpress。

如前述的方法，步骤2)中所述消化酶的用量为0.04mL/cm²细胞贴壁面积。

如前述的方法，步骤2)中室温消化时间为20秒。

如前述的方法，步骤2)中所述37℃培养箱孵育时间为2分钟。

如前述的方法，步骤2)中所述终止消化用的培养基体积为消化酶体积的2倍。

本发明的方法，可有效提高hERG-HEK293细胞在膜片钳试验时的稳定性，提高膜片钳试验中封接的成功率。

显然，根据本发明的上述内容，按照本领域的普通技术知识和惯用手段，在不脱离本发明上述基本技术思想前提下，还可以做出其它多种形式的修改、替换或变更。