[发明专利]一种用于诊断泡型棘球蚴病的串联蛋白及其克隆表达方法

权利要求书

1.一种串联蛋白EmAgB3-GGGS-Em18，其特征在于所述串联蛋白保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏编号CCTCC NO: M 2019622。

2.根据权利要求1所述的一种串联蛋白EmAgB3-GGGS-Em18，其特征在于所述串联蛋白用于诊断泡型棘球蚴病。

3.一种权利要求1或2所述的串联蛋白EmAgB3-GGGS-Em18的克隆表达方法，其特征在于所述方法包括如下步骤：

（1）扩增EmAgB3和Em18基因：

扩增EmAgB3基因，其中上游引物引入BamHI酶切位点，下游引物引入HindIII酶切位点，引物序列如下：

EmAgB3F：5´-CGGATCCGATGATGATGAAGTGACC-3´；

EmAgB3R：5´-CAAGCTTCTACTCATCCTCTTTAAT-3´；

扩增Em18基因，其中上下游引物引入BamHI酶切位点，引物序列如下：

Em18F：5´-GGATCCGAAGGAGTCTGACTTAGCGGAT-3´；

Em18R：5´-GGATCCTATTTGAGGTTGGCCAGCTTCGT-3´；

（2）EmAgB3-GGGS-Em18的基因合成：

根据EmAgB3和Em18的基因序列，在其上游加上NdeI酶切位点，在其下游加上XhoI 酶切位点的序列进行生物合成，并在EmAgB3和Em18之间加上连接蛋白GGGS蛋白；

（3）载体酶切：

将表达载体PET28a分别进行双酶切，酶切体系为：pET28a 1μg，10×FD Buffer 5μL，NdeI 1μL (10U/μL)，XhoI 1μL (10 U/μL)，ddH₂O 42μL；

（4）目的片段与载体连接：

将回收纯化好EmAgB3-GGGS-Em18 DNA片段分别与线性化的pET28a载体进行连接，连接体系为：2 × Seamless cloning Master Mix 10μL，线性pGEX-6P-1/pET28a 3μL，EmAgB3/EmAgB3-GGGS-Em18 5μL，Sterilized ddH₂O 2μL；

（5）转化E.coli DH5α 感受态细胞后筛选克隆：

将上述连接液转化E.coli DH5α 感受态细胞中，检测筛选出阳性克隆测序鉴定后，扩繁并提取重组pET28a质粒载体；

（6）诱导表达融合蛋白：

取1uL鉴定重组后的pGEX-6P-1/pET28a载体转化BL21（DE3），将培养的菌液按1:100比例接种于2L含有相应种类和浓度抗生素的LB液体培养基中，37℃，220 rpm培养，当OD值达到0.6时，添加终浓度为0.5 mM IPTG，20℃，220 rpm，诱导过夜，离心收集细胞菌体；

（7）蛋白的纯化：

超声破碎菌体，采用镍琼脂糖亲和层析纯化重组EmAgB3-GGGS-Em18。