[发明专利]一种用于诊断泡型棘球蚴病的串联蛋白及其克隆表达方法

说明书

本发明公开了一种用于诊断泡型棘球蚴病的串联蛋白及其克隆表达方法，该串联蛋白由EmAgB3基因和Em18基因通过GGGS串联后，转化E.coli并诱导表达的，串联后的蛋白，其分子量比原有蛋白增大了许多，随之抗原性也得到了增强。这为建立更加敏感和特异的血清学诊断方法、疫苗的研制和免疫预防奠定了基础。

技术领域

本发明涉及基因工程领域及蛋白质组学领域，具体为一种用于诊断泡型棘球蚴病的串联蛋白及其克隆表达方法。

背景技术

泡型棘球蚴病（Alveolar echinococcosis, AE）是由多房棘球绦虫（Echinococcus multilocularis, Em）的续绦期幼虫感染引起的一种人畜共患寄生性蠕虫疾病。该病在中国、日本、俄罗斯、中亚和北美部分地区流行严重。根治性肝切除手术是目前唯一比较可靠的治疗方法。因此，AE早期免疫诊断是降低本病死亡率的关键要求。对AE进行早期诊断并采取及时措施，可显著降低因AE造成的低死亡率。目前，对于该病的诊断，尤其是确诊该病，还主要依赖于病原学及影像学诊断。但影像学诊断需要影像学背景知识，操作复杂，却又不易识别较小和非典型的病灶，尤其又不易与脓肿或肿瘤进行区别当前，基于纯化的天然抗原Em2的酶联免疫吸附试验（Em2-ELISA）的诊断方法已被世界卫生组织推荐用于AE的血清诊断。

发明内容

本发明的目的一在于提供一种用于诊断泡型棘球蚴病的串联蛋白。

本发明提供的串联蛋白为Escherichia coli pET28a-BL21(DE3)/01/EmAgB3-GGGS-Em18（以下简称为EmAgB3-GGGS-Em18），该蛋白现保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏编号CCTCC NO: M 2019622，保藏日期2019年8月12日。

Em18是AE的一个新的蛋白质表位，具有显著的抗体反应性，Em18通过免疫印迹很容易就被检测到，是一种良好的血清学标记标签，可用于与其它寄生虫病的鉴别，其也可以鉴别活动期和非活动期AE的鉴别。EmAgB3抗原的同种型针对活动期AE的患者血清的特异性免疫反应性，克隆该基因并进行细菌的原核表达（rEmAgB3），免疫印迹表明，该蛋白的敏感性和特异性分别为90.9％（80/88）和98.5％（597/606），表明EmAgB3可适用于血清学诊断和AE的随访监测。且rEmAgB3的使用具有简易性和高重复性，可能适用于AE患者的临床诊断和流行区域的大规模流行病学调查。鉴于EmAgB3和Em18两个蛋白质良好的免疫原性，且为了增加蛋白的抗原性，利用一个linker蛋白GGGS，将这两个蛋白进行了串联表达，以提高对AE的检测率。

本发明的目的二，是提供一种串联蛋白EmAgB3-GGGS-Em18的克隆表达方法，具体步骤如下：

（1）扩增EmAgB3和Em18基因：

扩增EmAgB3基因，其中上游引物引入BamHI酶切位点，下游引物引入HindIII酶切位点，引物序列如下：

EmAgB3F：5´-CGGATCCGATGATGATGAAGTGACC-3´；

EmAgB3R：5´-CAAGCTTCTACTCATCCTCTTTAAT-3´；

扩增Em18基因，其中上下游引物引入BamHI酶切位点，引物序列如下：

Em18F： 5´-GGATCCGAAGGAGTCTGACTTAGCGGAT-3´；

Em18R：5´-GGATCCTATTTGAGGTTGGCCAGCTTCGT-3´。

（2）EmAgB3-GGGS-Em18的基因合成：