[发明专利]一种微孔载体检测抑制物的测定方法

说明书

本发明公开了一种微孔载体检测抑制物的测定方法，在微孔板的微孔内注入40μl的琼脂培养基制成微孔载体，在微孔载体上载入药物样品以及病原菌孢子，检测药物对孢子萌发的抑制作用，测定方法的步骤如下：1)用微孔板制备合格的微孔载体；2)将待测样品载入微孔载体；3)将病原菌孢子载入微孔载体；4)孢子萌发培养；5)结果观测。本发明的优点：1)一块常规微孔板可以制备96个微孔载体，可以实现测试体系微型化；2)一个测试单元只消耗样品液10μl，实现检测样本微量化。

技术领域

本发明涉及植物病理学技术，具体是一种微孔载体检测抑制物的测定方法。

技术背景

当前及今后相当长时期内，农药防治仍是植物病害防治的主要手段。探索和挖掘生物源农药是农药防治的重要方向，而生物源农药的早期探索挖掘往往要从自然界中采集或收集对植物病原菌具有抑制作用的物质，或者从生物体或生物产品中分离具有抑制作用的活性成分。显然，高效可行的抑制物识别检测手段将有利于提高生物源农药探索挖掘的成效和效率。当前识别抑制物对病原菌作用的常用方法包括利用琼脂培养基平板的测定方法，该测定方法的主要技术思想是，利用普通平皿制备含药培养平板，再接种入病原菌，然后培养观察药物对病原菌的抑制作用。该测定技术方案要求待测样本的样品量比较大，样品量过少时往往无法检测，容易错过或遗漏含量少的抑制活性物。

发明内容

本发明的目的是提供一种利用微孔载体技术检测有关物质对孢子萌发的抑制作用的测定方法。

本发明解决上述技术问题的技术方案如下：

一种微孔载体检测抑制物的测定方法，主要技术是在微孔板的微孔内注入40μl的琼脂培养基制成微孔载体，在微孔载体上载入药物样品以及病原菌孢子，检测药物对孢子萌发的抑制作用，测定方法的步骤如下：

1.用微孔板制备合格的微孔载体

1)微孔板的卡稳：准备一个能将微孔板卡稳及平置的、表面洁净的卡稳工具，转入无菌工作台，将洁净的微孔板卡于卡稳工具上。

2)琼脂培养基的熔化：取病原菌孢子萌发适用的用三角瓶盛装的琼脂培养基加热熔化。

3)培养基的80℃处置：预先将普通水浴锅加热恒温到80℃，将操作2)熔化的培养基放入该水浴锅中，平衡至80℃。

4)移液枪无泡移液的处置：把操作3)平衡至80℃的培养基转入无菌工作台，把移液枪取液量调到40μl，将枪头伸入80℃的培养基中反复吸排培养基，直至排液操作不出现气泡现象。

5)微孔载体的制备：操作4)无气泡现象后，过量按下移液枪吸取培养基，提起枪头并靠贴在三角瓶瓶口壁上脱除枪头外部粘附的培养基，再转移到微孔板的微孔内，注入40μl培养基到微孔底部，并将枪头留在培养基液内作环转移动，引导培养基均匀分布于微孔底面，冷却后形成一个琼脂培养基的微小平板，作为测试工作用的微孔载体。在注完一个微孔后，母指按住移液枪，返回移到80℃三角瓶培养基中，同样的吸液操作注制下一个微孔载体，连续操作直到注制的微孔载体数量达到测试需要的数量。

6)合格微孔载体的标识：将操作5)注制完毕的微孔板从卡稳工具中取出，在微孔板下方放置一个直线工具，反转微孔板，把板的底面朝向操作者，透过注制成的微孔载体观察直线，观察到直线弯曲或弯折的微孔载体是有气泡、或者没有平展的琼脂块，属于不合格的微孔载体，用记号笔在该微孔底部标注，未标注的微孔载体是合格微孔载体。

2.将待测样品载入微孔载体

将已配备的待检测的药物样品液及测试对照处理样品液，转至无菌工作台，用移液枪吸取样品液10μl，在枪头不触及微孔载体面的情况下点放于步骤1制备的合格微孔载体表面的中部，让其自动在微孔载体面上扩展分散，静置在无菌工作台让药物样品液干化，成为载药微孔载体。

3.将孢子载入微孔载体