[发明专利]一种短周期高效全雄中华鳖苗种的繁育方法

权利要求书

1.一种短周期高效全雄中华鳖苗种的繁育方法，其特征在于，包括以下步骤：

S1.鳖蛋控温孵化：控制鳖蛋孵化温室温度为28±1℃；

S2.鳖蛋雌激素处理：对中华鳖胚胎孵化至15-18时期的鳖蛋，每个时期进行一次药物处理，所述药物处理位置为最靠近胚胎的蛋壳面滴加雌二醇溶液；

S3.稚鳖温室养殖：稚鳖出壳后约1周时间，将稚鳖转移到温室成鳖养殖水池，控制水池温度32摄氏度并每日定时喂食至中华鳖性成熟。

S4.伪雌鳖筛选：设定一组中华鳖伪雌鳖性别鉴定引物对，包括一对目的基因18S rRNA和内参基因Gapdh，采用荧光定量PCR反应，利用性成熟的中华鳖表型雌鳖个体的目的基因18S rRNA在W和Z染色体上DNA拷贝数的不同将伪雌鳖筛选出来，所述目的基因18S rRNA和内参基因Gapdh引物均包括F和R两条引物，所述目的基因18S rRNA和内参基因Gapdh的引物序列如下所示：

表一.引物序列

Table1.Perimer sequences

S5.亲鳖塘繁育：将步骤S4鉴定出的伪雌鳖与雄鳖在亲鳖塘繁殖得到子代全雄鳖。

2.如权利要求1所述的一种短周期高效全雄中华鳖苗种的繁育方法，其特征在于，所述步骤S1鳖蛋控温孵化中鳖蛋放置在控温房的孵化箱孵化，所述孵化箱底部预先铺厚度为5cm的蛭石，调整鳖蛋的动物极向上放置，并在鳖蛋上覆盖约1cm厚的蛭石，所述蛭石湿度在8-12％RH。

3.如权利要求1所述的一种快速全雄中华鳖苗种的繁殖方法，其特征在于：所述步骤S2中雌二醇溶液滴加剂量为5μL/次，滴加浓度为50μg/μL，所述雌二醇溶液采用95wt％乙醇为溶剂进行配置。

4.如权利要求1所述的一种短周期高效全雄中华鳖苗种的繁育方法，其特征在于：所述步骤S2中中华鳖胚胎孵化时期采用胚胎发育形态特征判断，所述15-18时期的胚胎发育形态变化特征如下：

5.如权利要求1所述的一种短周期高效全雄中华鳖苗种的繁育方法，其特征在于，所述步骤S4中每日定时喂食的时间为早9点和晚5点，每次饲料投喂量为当前鳖体重的5-7％。

6.如权利要求1所述的一种短周期高效全雄中华鳖苗种的繁育方法，其特征在于，所述S4伪雌鳖筛选的具体步骤为：

S41、取50只以上确定性别为雄性的中华鳖血液DNA，每只个体采用20μL PCR反应液体系设置一组反应管，每组反应管中分别加入目的基因18S rRNA和内参基因Gapdh引物对，每个目的基因18S rRNA和内参基因Gapdh做3个平行重复孔，进行荧光定量PCR扩增，计算目的基因18S rRNA相对拷贝数；

S42、从步骤S41的雄性中华鳖中选取一只作为对照样本A，设定对照样本A的18S rRNA相对拷贝数为1，计算其他雄性中华鳖个体18S rRNA相对拷贝数相比于A的相对值，得到所有雄性中华鳖18S rRNA相对拷贝数的相对值，求所有雄鳖相对值的平均值和标准差SD，以作为阈值；

S43、挑选温室成鳖养殖池中性成熟中华鳖的雌鳖个体，提取血液DNA，以步骤S41中方式进行荧光定量PCR反应，得到每只表型雌鳖的目的基因18S rRNA相对拷贝数，计算每只表型雌鳖的相对拷贝数相对步骤S2中对照样本A的相对拷贝数的相对值Y；

S44、将步骤S43计算的相对值Y与步骤S42设定的阈值进行比较，如则为雌鳖，则为伪雌鳖。

7.如权利要求6所述的一种快速全雄中华鳖苗种的繁育方法，其特征在于，所述步骤S41中所述20μL PCR反应液体系为：

8.如权利要求6或7所述的一种短周期高效全雄中华鳖苗种的繁育方法，其特征在于，所述步骤S41中所述荧光定量PCR扩增的反应条件为：