[发明专利]一种检测DNA甲基化修饰影响转录因子与DNA序列结合的方法

说明书

本发明提供了一种检测DNA甲基化修饰影响转录因子与DNA序列结合的方法，涉及分子生物学技术领域。本发明所述方法中可排除杂蛋白对结合反应的影响，降低了实验假阳性，还可以快速精准的检测DNA甲基化修饰对转录因子结合的影响。以杨树OM47基因启动子区域DNA甲基化修饰对BPC2转录因子结合的影响为例，OM47基因启动子区域未被DNA甲基化修饰的DNA序列与BPC2蛋白具有明显的结合条带，并随着冷探针竞争浓度的增加逐渐变浅，而被DNA甲基化修饰的启动子序列与BPC2蛋白没有明显的结合条带，证明启动子区域的DNA甲基化修饰会抑制与转录因子蛋白的结合效率。

技术领域

本发明属于分子生物学技术领域，具体涉及一种检测DNA甲基化修饰影响转录因子与DNA序列结合的方法。

背景技术

转录因子(transcription factor，TF)是能与其靶基因启动子区域特定DNA序列结合的一类蛋白，直接激活或抑制靶基因转录，从而精细调控靶基因的表达模式与水平，在生物体生长发育及对外界环境的反应中起着至关重要的作用。DNA甲基化是一种重要的表观遗传修饰类型，在核酸序列不发生改变的条件下，通过DNA甲基化修饰使基因功能发生可遗传变化并最终导致表型变异，被认为是动植物调控基因表达的重要形式之一。在高等真核生物中，DNA甲基化主要通过DNA甲基转移酶将S-腺苷甲硫氨酸(S-adenosylmethionine,SAM)的甲基基团转移至胞嘧啶的第5位碳原子上，形成5-甲基胞嘧啶(5-methylcytosine,m5C)。目前，大量研究表明基因启动子区域的DNA甲基化修饰会抑制与转录因子的有效结合，并且DNA甲基化修饰被认为是基因沉默的标记，特别是启动子区被高水平甲基化修饰的基因通常处于失活状态，而转录因子与基因启动子区域结合位点的特异性结合是基因转录调控的关键因素，因此，检测DNA甲基化修饰对转录因子结合的影响，有利于进一步揭示DNA甲基化修饰以及转录因子调控其下游基因的功能分子机制。然而，目前没有快捷有效的方法检测启动子区域DNA甲基化修饰对转录因子结合的影响。

发明内容

有鉴于此，本发明的目的在于一种检测DNA甲基化修饰影响转录因子与DNA序列结合的方法，可以简单有效的研究DNA甲基化修饰对转录因子的结合影响。

为了实现上述发明目的，本发明提供以下技术方案：

本发明提供了一种检测DNA甲基化修饰影响转录因子与DNA序列结合的方法，包括以下步骤：(1)诱导转录因子表达编码蛋白，并纯化表达得到的蛋白，得到纯化蛋白；

(2)根据所述转录因子的结合位点设计特异性DNA探针，对所述特异性DNA探针的胞嘧啶进行甲基化修饰和生物素标记，得到启动子DNA探针；

(3)使所述纯化蛋白和所述启动子DNA探针发生结合反应，根据结合条带强弱与有无检测蛋白-DNA的特异性结合能力，从而评价DNA甲基化修饰对转录因子结合的影响；

步骤(1)和步骤(2)之间不存在时间上的先后顺序。

优选的，步骤(1)中利用原核表达方法诱导所述转录因子表达编码蛋白。

优选的，步骤(1)中利用表达得到的蛋白所携带的标签进行纯化。

优选的，步骤(3)进行所述结合反应时，还包括：设置所述纯化蛋白与未进行DNA甲基化修饰以及所述启动子DNA探针的结合反应体系，同时设置冷探针的竞争梯度，从而根据结合条带强弱与有无检测蛋白-DNA的特异性结合能力。