[发明专利]烟草Nt-miRNA203在烟碱含量调节中的应用

权利要求书

1.一种烟草miRNA，其特征在于，所述烟草miRNA为Nt-miRNA203成熟体，其序列如SEQID NO.1所示，具体为：

AAUUUUCUGUUGGGCUCGGAACGU。

2.权利要求1中的所述Nt-miRNA203成熟体的前体RNA，其特征在于，所述前体RNA的序列如SEQ ID NO.2所示，具体为：

UGGAAGGAAUUAACCCAACAACCUUGGGCAACAGUGAGGGGAUUAAAUUCCUUAAGGAAACACAAUUUUCUGUUGGGCUCGGAACGUUGUUCAUCUAAUUCUCUUUCU。

3.权利要求1中的所述Nt-miRNA203的基因，其特征在于，其序列如SEQ ID NO.3所示，具体为：

TGCATATTCTCCCTTCTTTCTTCTACATTTCTGCATTGTTTTCCAAAAGTAAAAACATAAGCATCAGTGTAGTTCATTGACGTTTGTTGAGTTCGACGAAGTCCTATAATTTTCATTGTAGGTATTACAGAATAGTTGTTCCGTTCTATCCTGGAAGGAATTAACCCAACAACCTTGGGCAACAGTGAGGGGATTAAATTCCTTAAGGAAACACAATTTTCTGTTGGGCTCGGAACGTTGTTCATCTAATTCTCTTTCTATCTTTTGTTTCTGATTTCGTTTTATTTTGCAGAAATTATATTTTCGAATACAAATACTAACAAGCTTAAGGAATTTAGTTTTTTTTATATTCTGTATTCATCTTACTTTCTGCTTTGGGAGACTAAAATCCTAGTGATTTT。

4.权利要求3所述Nt-miRNA203基因序列制备方法，其特征在于，通过PCR扩增方法制备获得，具体包括如下步骤：

（1）提取基因组

以烟草红花大金元品种叶片为样品，提取其基因组DNA；

（2）设计扩增用引物序列如下：

Nt-miRNA203-F：5’- TGCATATTCTCCCTTCTTTCTTC -3’，

Nt-miRNA203-R：5’- AAAATCACTAGGATTTTAGTCTCCC -3’；

（3）PCR进行扩增

以步骤（1）中所制备的DNA为模板，利用步骤（2）中所设计引物，进行PCR扩增，扩增产物即为Nt-miRNA203的401bp长度的基因序列。

5.含有权利要求3所述Nt-miRNA203基因序列的超表达载体，其特征在于，以pCAMBIA2300s作为载体，重组有401bp长度的Nt-miRNA203基因序列。

6.权利要求1所述烟草miRNA在烟碱含量调节中的应用，其特征在于，所述Nt-miRNA203成熟体与烟草中烟碱转运蛋白MATE1调节相关，进而调节烟碱含量分布情况。

7.一种培育低烟碱含量的烟草品种的培育方法，其特征在于，通过将含有权利要求3所述Nt-miRNA203基因序列重组超表达载体转化烟草后，进一步筛选获得转基因植株，该转基因植株烟叶中烟碱含量相较于原始出发植株烟叶中烟碱含量明显降低。

8.如权利要求7所述培育低烟碱含量的烟草品种的培育方法，其特征在于，所述重组超表达载体的原始出发载体为pCAMBIA2300s；

转化烟草时所述烟草对象为红花大金元。