[发明专利]一种气单胞菌属内不同物种的条形码鉴定引物、鉴定方法和试剂盒

说明书

本发明公开了一种气单胞菌属内不同物种的条形码鉴定引物、鉴定方法和试剂盒。它包括F：5’‑GGAATTCGCAACCGTTCTGGCTCAGGCTATCGT‑3’；R：5’‑TGTCGACGACGGCAGCCACTTTCAC‑3’。16S rRNA序列分析鉴定方法普遍认为,序列相似性达到97％以上即视为同种水平，而实际应用中往往出现气单胞菌属多个不同的物种满足该序列相似性要求。这种情况下，16S rRNA序列分析只能鉴定到属水平而无法准确鉴定到种。本发明可以解决上述问题，待测物种cpn60序列经BLAST比对后，满足相似性大于98.8％且覆盖度大于98％的比对结果高度专一，为气单胞菌属下特定种，比对结果中不存在不同物种的情况。

技术领域：

本发明属于生物学技术领域，具体涉及一种气单胞菌属内不同物种的条形码鉴定引物、鉴定方法和试剂盒。

背景技术：

气单胞菌(Aeromonas spp)隶属弧菌科，兼性厌氧，是一种革兰阴性细菌，广泛分布于河流、湖泊、池塘、海水、河口等水生生境。气单胞菌可感染多种动物，引起动物患病甚至死亡，给水产养殖业带来巨大的挑战。此外，致病性气单胞菌还可引起人发生急性腹泻，菌血症、脑膜炎、心内膜炎等疾病，给公共卫生安全带来隐患，给人类健康带来影响。因此,如何快速准确地对病原菌进行鉴定,从而有针对性地对病情进行控制,在生产实践上具有重要的意义。

目前，针对气单胞菌的检测主要采用生理生化特征结合16S rRNA序列分析进行鉴定。生理生化特征旨在利用不同种类的气单胞菌对底物的分解利用能力、代谢产物方面存在的差别，根据一系列生化指标将不同种类的气单胞菌区分开来。该方法缺点是需要综合利用生化指标及其培养特征进行判断，检测过程繁琐,试验所需时间比较长。16S rRNA序列分析是细菌种属鉴定中最常用的分子技术,该基因通用性好、广泛存在于细菌内，利用该基因序列可实现在属的水平上对几乎所有细菌进行鉴定。但16SrRNA序列分析也存在一定局限性。气单胞菌不同种的16SrRNA基因间差异较低,仅0.06％～0.66％，根据普遍采用的标准,序列相似性达到97％以上即视为同种水平,而使用16SrRNA序列进行分析,可能会出现与两个或两个以上的种相似性均大于97％的情况,而导致无法准确鉴别种类。

DNA条形码鉴定技术是一种利用基因在不同物种之间进化的差异来对物种进行鉴别的生物物种鉴定技术。DNA条形码技术利用标准的DNA片段，在分子水平上建立新的生物识别系统，借助分子生物学和生物信息学的方法实现对物种快速准确地鉴定，是对传统物种鉴定方法的有效补充。目前很多分类学家和检测技术人员正研究寻找适合细菌种快速鉴定的通用DNA条形码基因。

发明内容：

本发明的第一个目的是提供一种气单胞菌属不同物种的条形码鉴定引物。

所述的气单胞菌属不同物种的条形码鉴定引物，包括：

F：5’-GGAATTCGCAACCGTTCTGGCTCAGGCTATCGT-3’，具体如SEQ ID NO.1所示；

R：5’-TGTCGACGACGGCAGCCACTTTCAC-3’，具体如SEQ ID NO.2所示。

本发明第二个目的是提供一种气单胞菌属不同物种的条形码鉴定方法，包括以下步骤：

A、提取待测气单胞菌基因组DNA；

B、使用上述条形码鉴定引物进行PCR扩增，产物经琼脂糖凝胶电泳检测合格后送至公司进行测序；

C、将待测PCR产物序列作BLAST比对分析，以序列覆盖度大于98％且相似度大于98.8％作为筛选标准，GenBank数据库中满足此条件的物种与待测物种为同一物种。

优选，从GenBank上下载气单胞菌属代表种的cpn60序列，与待测序列一起构建系统发育树，聚为同一最小分支具有最高的同源性。以此辅助验证鉴定结果。