[发明专利]热稳定提高的木聚糖酶突变体、其制备及其应用

说明书

本发明提供了一类热稳定提高的木聚糖酶突变体、其制备及其应用。本发明确定了与热稳定性相关的氨基酸位点，通过进行定点改造，获得热稳定性显著提高的突变体。本发明还提供了编码该突变体的核酸、表达该突变体的构建体，涵盖多个突变体的木聚糖酶突变体文库，以及利用所述突变体降解木聚糖的方法等。

技术领域

本发明属于蛋白质工程和基因工程领域，涉及到热稳定性提高且比活力较好的木聚糖酶突变体、其制备及其应用。

背景技术

半纤维素是地球上存在的最丰富的非纤维素杂多糖，是植物细胞和细胞壁的主要组成成分。将半纤维素高效转化成其它有价值的副产物，不但有着良好的经济效益，同时也对环境保护起着积极作用。

植物细胞和细胞壁中的半纤维素的主要成分为木聚糖。木聚糖是植物细胞中的主要结构多糖，是自然界中第二丰富的多糖，约占地球上所有可再生有机碳的三分之一。

木聚糖，由木糖分子(D Xylose)以β-1,4-糖苷键连结成主链；阿拉伯呋喃糖苷基、葡糖醛酸基或乙酰基等连结成支链。在自然界中富含木聚糖的原料来源广泛，包括硬木、软木、秸秆、稻草、麸皮等农、林、工业废弃物及城市固体垃圾等。且不同植物所含木聚糖的多少也有所差别，硬材中所含木聚糖比软材中多，硬材中能占到干重的15～30％，软材中一般占干重的7～12％。而在一些一年生植物如小麦、棉子壳中，木聚糖含量则高达30％以上。

木聚糖酶是糖苷酶(O-糖苷水解酶，EC 3.2.1.x)，其催化木聚糖中1,4-βD-木糖苷键(β-1,4-糖苷键)的内切水解。根据其结构和催化结构域，木聚糖酶可主要划分为GH 10家族和GH11家族。木聚糖酶GH10家族包括内切-1,4-β-木聚糖酶(EC3.2.1.8)，内切-1,3-β-木聚糖酶(EC 3.2.1.32)和纤维二糖水解酶(EC 3.2.1.91)，其中以内切-1,4-β-木聚糖酶为主。和GH10家族相比，GH11家族只能专一的作用于D-木糖，可以称为“真正意义上的木聚糖酶”，有着分子量低，活力高等特点。

在工业上，木聚糖酶有着广泛的应用。在食品行业中，木聚糖酶被用于水果、蔬菜和植物等的加工，以促进浸渍过程；在造纸工业中，木聚糖酶被用于促进制浆处理；在纺织工业中，木聚糖酶被用于纺织品的酶解中，减少或替代化学混麻方法，以降低环境污染；在饲料行业中，木聚糖酶被添加于单胃动物以及反刍动物的饲料当中，以提高饲料的可消化性和营养价值；在生物能源领域方面，木聚糖酶可与其他纤维素酶、半纤维素酶共同应用于将木质纤维素转化为燃料乙醇的工业生产中，而且近些年随着五碳糖发酵途径及菌株的研究、开发，利用细菌、酵母及丝状真菌发酵木聚糖水解产物木糖生产燃料乙醇的工艺日趋成熟，木聚糖酶在生物能源领域内扮演的角色越来越重要。

在工业应用上的木聚糖酶大都来源于细菌或真菌，它们大都为嗜中温。然而在生产过程中，往往需要经过高温处理环节，这样导致木聚糖酶的性能大为折扣。获得热稳定性优良的木聚糖酶突变株将使其应用更广泛，效率更高。因此，本领域需要开发适应于不同的高温条件且能保持较为理想的酶活性

发明内容

本发明的目的在于提供热稳定提高的木聚糖酶突变体、其制备及其应用。

在本发明的第一方面，提供一种提高木聚糖酶的热稳定性的方法，包括：对木聚糖酶的氨基酸序列进行突变，对应于野生型木聚糖酶所示的氨基酸序列(SEQ ID NO:2)，突变选自下组的位点或其组合：第14位，第28位，第29位，第30位，第31位，第41位，第52位，第131位，第133位，第192位，第203位。

在一个优选例中，第14位突变为His(H)；第28位突变为Val(V)；第29位突变为Ser(S)或Ala(A)；第30位突变为Ser(S)或Pro(P)；第31位突变为His(H)；第41位突变为Arg(R)；第52位突变为Leu(L)；第131位突变为Cys(C)；第133位突变为Glu(E)；第192位突变为Asp(D)；和/或，第203位突变为Val(V)。