[发明专利]一种诱导脂肪干细胞分化为多巴胺能神经元的方法

权利要求书

1.一种诱导脂肪干细胞分化为多巴胺能神经元的方法，其特征在于，所述方法包括：

采用抽脂术获取自体脂肪组织样品，并在无菌条件下至多冰封保存6小时内用于脂肪干细胞的分离培养；

采用氯化钠生理盐水对自体脂肪组织样品进行冲洗，广泛冲洗4～6遍以便充分去除样品中含有的脂肪碎片、油脂、血细胞和局部麻醉剂；

采用25ml的移液管经冲洗完毕的自体脂肪组织样品移入新的50ml无菌离心管中，之后采用等体积的脂肪消化酶消化脂肪组织，振荡混匀后在37℃的恒温摇床中振荡25分钟，振荡过程中保持230r/min的均匀转速旋转，并且振荡过程中每间隔5分钟用手自上向下混匀一次；

振荡完毕以后，放置在离心机上进行离心分离，其中，离心分离过程中保持离心机的温度在28℃，离心机的转速为250r/min，离心分离的时间不小于5分钟；

之后丢掉顶层液体，采用生理盐水重悬自体脂肪组织样本后采用100μm分子筛进行筛选之后，再次采用离心机进行离心分离，离心分离过程中仍保持离心机的温度在28℃，离心机的转速为250r/min，离心分离的时间不小于10分钟；

之后再次采用生理盐水重悬自体脂肪组织样本并进行冲洗之后，采用250r/min的离心机再次进行离心分离10分钟之后，加入脂肪干细胞培养液并调整细胞浓度至1.5x10⁵～2.5x10⁵/cm²，培养48小时以使细胞融合度达到85％～90％之间；

当细胞融合度达到85％～90％之间后，采用吸管吸出培养瓶内的培养基，加入PBS/生理盐水洗涤细胞一次，之后加入1～2ml胰蛋白酶替代物消化2～3分钟，在显微镜下观察到细胞变圆后加入4ml培养基终止消化，之后轻轻吹吸若干次以使培养细胞从培养瓶的底部脱落；

将脱落形成的细胞悬液吸入15ml离心管中，采用280r/min的离心机进行离心分离10分钟后，舍弃上次清液，并加入2ml培养基进行吹吸混匀，吹吸混匀后平均分配到3个新的培养瓶中；

在新的培养瓶中补加适量培养基之后轻轻晃动培养瓶，待细胞均匀分布之后放入37℃的5％二氧化碳培养箱中进行培养以使脂肪干细胞发生传代；

将发生传代反应到第三至第五代的脂肪干细胞放置在明胶包被的6孔培养板中进行诱导分化培养，培养密度为20000个/孔，培养一天之后采用生理盐水进行清洗一遍；

清洗完毕之后将生长培养基替换为含有低糖DMEM、1％FBS、0.6％B27、250ng/ml SHH、100ng/ml FGF8、50ng/ml bFGF和100g/ml L-谷氨酰胺的诱导培养基继续进行诱导分化培养；

诱导分化培养至第八天时，采用生理盐水进行清洗之后将生长培养基替换为DMEM低糖、50ng/ml BDNF、100g/ml L-谷氨酰胺的转化培养基，并将细胞温育培养4天，诱导分化后得到多巴胺能神经元。

2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述采用氯化钠生理盐水对自体脂肪组织样品进行冲洗之前，所述方法还包括：

提取1～2ml的自体脂肪组织样品进行传染病和微生物检测，检测合格之后采用氯化钠生理盐水对自体脂肪组织样品进行冲洗。