[发明专利]一种诱导脂肪干细胞分化为多巴胺能神经元的方法

说明书

本发明公开一种诱导脂肪干细胞分化为多巴胺能神经元的方法，属于生物医疗技术领域，通过对脂肪干细胞的分离、脂肪干细胞的传代培养、诱导培养转化得到多巴胺能神经元，实现了利用自体来源的脂肪组织分离培养得到大量脂肪干细胞，通过使用两种特定培养基将脂肪干细胞转化为多巴胺能神经元，能够安全、有效的获得批量稳定的多巴胺能神经元，具有较高的分化率，通过免疫荧光及细胞计数实验表明，多巴胺能神经元转化率为90.4±0.76，生存率为98.9±0.55，使用多巴胺ELISA试剂盒检测转化后的多巴胺能神经元分泌多巴胺的数量平均为450pg/ml，因此，证实本发明所提供的脂肪干细胞提取及转化步骤具有温和、稳定的特点，提取的细胞适用于大批量应用。

技术领域

本发明涉及生物医疗技术领域，尤其涉及一种诱导脂肪干细胞分化为多巴胺能神经元的方法。

背景技术

帕金森(Parkinson’s disease,PD)是一种常见的神经退行性疾病，其以黑质中多巴胺能神经元(dopaminergic neurons)的消失及路易小体的积聚为主要医学特征，以肌强直、动作迟缓、运动障碍、静止性震颤、睡眠行为异常等为临床表现。在我国，65岁以上中老年帕金森患病率为1.7％，随着老龄化现象逐年加重，帕金森患者的诊断与治疗应引起巨大关注。目前，帕金森的主要治疗方案为促多巴胺释放和缓解运动功能，通过药物治疗可在一定程度上缓解症状，但长期服用产生药物耐受，药物效果逐渐失效；同时随着病情进一步进展，药物剂量逐渐增加，出现严重的药物副作用。因此，开发新型安全有效的帕金森治疗方法是急需解决的重要问题。

干细胞治疗在神经退行性疾病上具有广大应用前景，先前大量动物实验，证实干细胞及诱导的多巴胺能神经元等在阿尔茨海默症及帕金森的治疗中均显示出一定的治疗效果。其中，帕金森由于患者黑质等分泌多巴胺的神经元衰老或凋亡，使神经系统中多巴胺分泌减少或无法正常分泌多巴胺，导致帕金森病的发生。临床上的治疗方案一个是药物治疗，患者通过摄入多巴胺替代品缓解临床表现，而这种方法疗效有限，随病情进展，药物效果减弱或失效，且随着用药剂量的加大，副作用明显加大，导致人体不能耐受，病人疾病治疗失效；另一种治疗方法是脑深部电极刺激(DBS)，俗称脑起搏器，在深部电极的刺激下，促使黑质细胞产生多巴胺，然而这种DBS刺激方案因个体差异而不同，选择这种治疗方式时病人筛选具有严格的适应症，控制器的调试较复杂，易导致细胞开关反应过激出现副作用，且病情变化时固定参数不能适应病人病情的变化的需要，有时治疗效果有限，另外DBS应用一段时间后效果逐渐减弱或消失，同时得不到有效治疗。目前，国内外研究通过使用胎脑神经干细胞、胚胎神经干细胞、iPSCs细胞等进行移植来治疗帕金森病，虽得到一定的初步结果，但由于伦理问题难以通过，利用基因编辑技术等获得的诱导性细胞具有致瘤性，且此方法存在技术复杂、成本过高、实验不易控制，批次间纯度不一等问题，众议较多，限制了以上干细胞方法的应用，难以进一步发展。

发明内容

本发明提供一种诱导脂肪干细胞分化为多巴胺能神经元的方法，利用自体来源的脂肪组织分离培养得到大量脂肪干细胞后，通过使用两种特定培养基将脂肪干细胞转化为多巴胺能神经元，能够实现脂肪干细胞培养及转化，能够稳定分离、扩增脂肪干细胞，且能高效的实现脂肪干细胞转化为能够分泌多巴胺的多巴胺能神经元，可以广泛应用于老年痴呆症的治疗。

本发明提供的具体技术方案如下：

本发明提供的一种诱导脂肪干细胞分化为多巴胺能神经元的方法包括：

采用抽脂术获取自体脂肪组织样品，并在无菌条件下至多冰封保存6小时内用于脂肪干细胞的分离培养；

采用氯化钠生理盐水对自体脂肪组织样品进行冲洗，广泛冲洗4～6遍以便充分去除样品中含有的脂肪碎片、油脂、血细胞和局部麻醉剂；