[发明专利]一种干细胞冻存方法及其使用的细胞冻存液

权利要求书

1.一种干细胞冻存方法，其特征在于：包括以下步骤：

S1、配制Ⅰ液：将1％bFGF w/v与1％EGF w/v混合与人血白蛋白中，取混合液定容至100ml，将混合液保存备用；

S2、配制Ⅱ液：将血清替代物Knockout Serum replacement、细胞色素C、甜菜碱、抗冻蛋白、葡萄糖、低分子葡聚糖、甘露聚糖、氯化钠、乳酸钠、氯化钾、氯化钙和二甲基亚砜依次加入并混合，之后取混合液保存备用；

S3、取人脂肪间充质干细胞，用PBS洗涤细胞1次，然后用0.05％胰蛋白酶消化细胞，使细胞由梭性变为圆形，立即用培养基终止消化，得到细胞悬液，之后用移液管将细胞悬液转移至离心管中，进行离心，舍弃上层清液；

S4、取用Ⅰ液重悬细胞，并且在4℃的温度条件下孵育10min；

S5、取用Ⅱ液重悬细胞，之后将细胞悬液分装至2ml冻存管中；

S6、将分装完成的冻存管管置于程序降温盒中，将细胞冻存管置于液氮中长期保存。

2.根据权利要求1所述的一种干细胞冻存方法，其特征在于：在步骤S1中，混合液置于4℃环境保存。

3.根据权利要求1所述的一种干细胞冻存方法，其特征在于：在步骤2中，取混合液之后，将混合液于4℃环境预冷备用；或者将混合液分装，然后置于-20℃冰箱中长期保存，使用前4℃融化后使用。

4.根据权利要求1所述的一种干细胞冻存方法，其特征在于：在步骤S3中，离心处理中，离心机的转速为1100rpm，离心时间为5min。

5.根据权利要求1所述的一种干细胞冻存方法，其特征在于：在步骤S5中，Ⅱ液的干细胞冻存密度为1×106cell/ml，每个试管中Ⅰ液和Ⅱ液混合后冻存液的含量为1ml。

6.根据权利要求1所述的一种干细胞冻存方法，其特征在于：在步骤S6中，在冻存管置于液氮中长期保存之前，放入-80℃冰箱保存1-2天。

7.一种权利要求1中的干细胞冻存方法使用细胞冻存液，其特征在于：包括Ⅰ液和Ⅱ液，其中Ⅰ液包括人血白蛋白、bFGF和EGF，其中bFGF的浓度为：1％w/v，EGF的浓度为：1％w/v，使用人血白蛋白定容至100ml；

Ⅱ液包括组分：血清替代物Knockout Serum replacement、细胞色素C、甜菜碱、抗冻蛋白、葡萄糖、低分子葡聚糖、甘露聚糖、氯化钠、乳酸钠、氯化钾、氯化钙和二甲基亚砜，其中：细胞色素C的浓度为：1.2％w/v、甜菜碱的浓度为：0.3％w/v、抗冻蛋白的浓度为：0.3％w/v、葡萄糖的浓度为：3.5％w/v、低分子葡聚糖的浓度为：1.5％w/v、甘露聚糖的浓度为：：1％w/v、氯化钠的浓度为：0.1％w/v、乳酸钠的浓度为：0.1％w/v、乳酸钠的浓度为：0.1％w/v、氯化钾的浓度为：0.1％w/v、氯化钙的浓度为：0.2％w/v、二甲基亚砜的浓度为：3％w/v。