[发明专利]一种干细胞冻存方法及其使用的细胞冻存液

说明书

本发明公开了一种干细胞冻存方法及其使用的细胞冻存液，属于干细胞保存和培育技术领域，干细胞冻存方法包括以下步骤：S1、配制Ⅰ液；S2、配制Ⅱ液；S3、取人脂肪间充质干细胞，用PBS洗涤细胞1次，然后用0.05％胰蛋白酶消化细胞，使细胞由梭性变为圆形，得到细胞悬液，然后进行离心；S4、取用Ⅰ液重悬细胞；S5、取用Ⅱ液重悬细胞；S6、将冻存管管置于程序降温盒中，将细胞冻存管置于液氮中长期保存，干细胞冻存液包括Ⅰ液和Ⅱ液，Ⅰ液包括人血白蛋白、bFGF和EGF，Ⅱ液包括血清替代物细胞色素C、甜菜碱、抗冻蛋白、葡萄糖、低分子葡聚糖、甘露聚糖、氯化钠、乳酸钠、氯化钾、氯化钙和二甲基亚砜，本发明的优点在于提高细胞冻存品质和稳定性。

技术领域

本发明涉及干细胞保存和培育技术领域，特别涉及一种干细胞冻存方法及其使用的细胞冻存液。

背景技术

干细胞是一类具有自我复制能力的多潜能细胞。在一定条件下了分化为多种功能细胞，根据干细胞所处的发育阶段，可分为胚胎干细胞和成体干细胞。根据干细胞的发育潜能可分为全能干细胞、多能干细胞和单能干细胞。

脂肪间充质干细胞是存在于脂肪组织的成体多能干细胞，在一定条件下课分化为骨、软骨、心肌、神经、脂肪等多种组织细胞。目前脂肪间充质干细胞在人体抗衰老方面的研究已取得很多进展，在神经系统、免疫系统、运动系统等系统的疾病治疗方面也在不断突破。它作为再生医学资源，在人体抗衰老和疾病治疗都有非常重要的价值。

干细胞的保存对于干细胞的应用起着基础性的作用。将干细胞从人体组织中分离培养后，经过鉴定检测合格后，将其保存，以便于临床的使用。细胞冻存是指将细胞置于低温环境中，是细胞暂时处于停止生长的状态，以保持其细胞生物学特性。

在冻存中会使用细胞保存液(也称为细胞冻存液)作为供给细胞生命代谢所需营养物质，同时也要防止在冷冻中所产生的冰晶对细胞的损伤。目前常规的细胞冻存液，主要是由胎牛血清、细胞培养液、二甲基亚砜(DMSO)等物质组成。但胎牛血清属于异源性物质，存在引入污染和过敏源的风险，可能会引起未知的不良反应，以及会影响临床治疗的效果，因此不适于临床的应用。

发明内容

本发明的目的是提供一种干细胞冻存方法及其使用的细胞冻存液，其优点在于选用人血白蛋白作为主料降低冰晶形成数量，降低细胞在冻存时结冰晶而造成的机械损伤，人血白蛋白配合、bFGF和EFG的混合液、甜菜碱等辅料使细胞建立一层保护机制，提高细胞冻存品质和稳定性，延长保质期，有利于大批量干细胞生产平台批量使用，降低综合成本。

本发明的上述技术目的是通过以下技术方案得以实现的：

一种干细胞冻存方法，包括以下步骤：

S1、配制Ⅰ液：将1％bFGF w/v与1％EGF w/v混合与人血白蛋白中，取混合液定容至100ml，将混合液保存备用；

S2、配制Ⅱ液：将血清替代物Knockout Serum replacement、细胞色素C、甜菜碱、抗冻蛋白、葡萄糖、低分子葡聚糖、甘露聚糖、氯化钠、乳酸钠、氯化钾、氯化钙和二甲基亚砜依次加入并混合，之后取混合液保存备用；

S3、取人脂肪间充质干细胞，用PBS洗涤细胞1次，然后用0.05％胰蛋白酶消化细胞，使细胞由梭性变为圆形，立即用培养基终止消化，得到细胞悬液，之后用移液管将细胞悬液转移至离心管中，进行离心，舍弃上层清液；

S4、取用Ⅰ液重悬细胞，并且在4℃的温度条件下孵育10min；

S5、取用Ⅱ液重悬细胞，之后将细胞悬液分装至2ml冻存管中；

S6、将分装完成的冻存管管置于程序降温盒中，将细胞冻存管置于液氮中长期保存。

进一步的，在步骤S1中，混合液置于4℃环境保存。