[发明专利]一种递送siRNA的壳聚糖衍生物纳米颗粒的制备方法

说明书

本发明涉及一种递送siRNA的壳聚糖衍生物纳米颗粒的制备方法，属于基因生物技术领域。本发明通过带正电的壳聚糖盐酸盐溶液与可抑制结肠癌细胞增殖和迁移相关的蛋白表达的siRNA溶液混合，再加入带负电的羧甲基壳聚糖溶液，通过分子间静电相互作用，自组装形成递送siRNA的壳聚糖衍生物纳米颗粒（siRNA‑CDNPs）。所述递送siRNA的壳聚糖衍生物纳米颗粒在pH值1.2条件下有效保护siRNA，在结肠癌细胞环境为pH值5.5条件下，通过对外界刺激（超声）的响应，实现siRNA的可控释放；siRNA‑CDNPs可有效抑制结肠癌细胞中β‑catenin蛋白表达，有望抑制癌细胞的增殖和迁移。本发明制备方法操作简单、绿色环保、成本低。

技术领域

本发明属于基因生物技术领域，具体涉及一种pH敏感性的siRNA/壳聚糖衍生物纳米系统的制备和应用。

背景技术

基于基因的治疗方法在调控大量靶mRNA分子沉默方面具有很大的潜力，最终可降低靶蛋白水平。然而，这一基因沉默技术的应用还需要克服挑战，包括生理条件下siRNA的快速降解及其通过带负电荷的胞质膜非常困难。实现siRNA治疗效能的关键挑战是开发和设计新型可降解载体，使其具有安全、充分的基因传递效能。目前，结肠癌肝转移的化疗或切除的患者5年生存率低于50%。一般认为，与放疗和化疗相比，基因治疗的副作用相对较小，在大多数结肠癌细胞或者其他肿瘤细胞增殖与β-catenin的过度表达有关。

壳聚糖是一种具有生物相容性和低免疫原性的聚合物，已被用于通过静电相互作用建立针对上皮表面的药物和营养传递系统。它具有细胞渗透增强性能和生物粘附特性可以有效地促进粘膜递送。然而，壳聚糖的应用往往受到其水溶性的限制。带负电荷的羧甲基壳聚糖和带正电荷的壳聚糖盐酸盐属于水溶性壳聚糖衍生物，它们与壳聚糖分子骨架相似，具有壳聚糖的独特优点，同时也弥补壳聚糖只能溶于酸性溶液的不足，是理想的新型口服递送营养素的载体。因此，水溶性壳聚糖为基础的给药系统具有口服给药途径的重要优势，这将有助于形成高效递送基因的纳米系统。结肠癌环境的复杂性使其难以实现siRNA的按需释放。超声可使功能物质/药物从水凝胶和微泡中可控释放进入机体环境。超声触发的智能给药系统可以为siRNA的按需、可重复、可调节给药提供有希望的基础。目前，尚未有羧甲基壳聚糖和壳聚糖盐酸盐封装siRNA形成的纳米颗粒，促进细胞对siRNA的摄取，胃液中保护siRNA不被降解，肠道中控制siRNA的释放。利用上述壳聚糖衍生物（羧甲基壳聚糖和壳聚糖盐酸盐）制备递送siRNA的壳聚糖衍生物纳米颗粒，使siRNA可控释放、有较高的基因转染率和沉默效率即为本发明的研究重点。有望广泛应用于疾病的基因治疗，具有良好的临床应用前景。

发明内容

为了实现高效负载siRNA，可控释放siRNA，有效递送，并促使结肠癌细胞中β-catenin蛋白表达减少，有效抑制结肠癌细胞增殖和迁移，本发明提供一种递送siRNA的壳聚糖衍生物纳米颗粒的制备方法。

一种递送siRNA的壳聚糖衍生物纳米颗粒的制备方法的操作步骤如下：

将带正电的浓度1 mg/mL的壳聚糖盐酸盐溶液和浓度7.24 μM的siRNA溶液混合均匀，加入带负电的浓度2 mg/mL的羧甲基壳聚糖溶液，磁力搅拌；通过分子间静电相互作用自组装形成递送siRNA的壳聚糖衍生物纳米系统颗粒；

其中壳聚糖盐酸盐溶液、siRNA溶液和羧甲基壳聚糖溶液体积比为30~60：60~30：5。

进一步限定的技术方案如下：

所述带正电的浓度1 mg/mL的壳聚糖盐酸盐溶液由10 mg的壳聚糖盐酸盐加入到10 mL超纯水中直至完全溶解制得。

所述带负电的浓度2 mg/mL的羧甲基壳聚糖溶液由20 mg的壳聚糖盐酸盐加入到10 mL超纯水中直至完全溶解制得。

所述磁力搅拌为转速800-1300 rpm条件下的磁力搅拌。