[发明专利]猪圆环病毒1到4型四重实时荧光PCR鉴别检测方法

说明书

猪圆环病毒1到4型四重实时荧光PCR鉴别检测方法，属于生物技术领域。本发明针对不同基因型PCV的ORF1和ORF2基因设计能鉴别PCV1,PCV2,PCV3和PCV4的特异性引物和探针序列，用不同荧光素标记的PCV1‑4毒株的探针，每条探针可用任意一种荧光素标记，且四种探针标记的必须是通过不同检测通道检测的荧光素，将分别用于检测PCV1‑4毒株的上述引物和探针，或者用于鉴别PCV1‑4毒株的上述引物和探针，置于同一个反应管中，使用荧光PCR扩增仪进行实时荧光PCR反应，对同一个样本进行一次检测操作即可完成PCV1到4型毒株的鉴别检测。

技术领域

本发明属于生物技术领域，涉及四重实时荧光PCR检测，具体涉及猪圆环病毒1到4型四重实时荧光PCR鉴别检测方法。

背景技术

猪圆环病毒(Porcine circovirus,PCV)属于圆环病毒科，圆环病毒属。PCV是一种目前已知最小的环状单股DNA病毒，病毒颗粒直径约17nm，无囊膜，呈二十面体对称。目前，PCV可以分为四种基因型(PCV1,PCV2,PCV3,PCV4)。1974年，PCV1首先从污染的猪肾细胞系PK-15中发现。目前认为PCV1对猪无致病性。1998年，首次报道PCV2与断奶仔猪多系统衰竭综合征和猪皮炎肾病综合征等密切相关。2015年，PCV3在猪皮炎肾病综合征和流产猪群中首次发现。2019年，PCV4首次在我国湖南发病猪群中发现。PCV四种基因型之间核苷酸同源性较低，为35％～75％。由于PCV不同基因型毒株的致病性、抗原性和基因组均具有显著差异，因此，对不同亚型的PCV进行快速鉴别诊断对临床上采取针对性的有效防控措施具有重要意义。

目前检测PCV的经典方法主要包括血清学检测和PCR检测等。但是这些方法比较费时费力、敏感性低且容易出现假阴性。目前虽然已经建立了针对不同PCV亚型的实时荧光PCR检测方法，但是均不能对PCV1到PCV4四种基因型病毒同时进行鉴别检测。因此，本发明旨在建立一种快速简便、特异性强、敏感性高、可重复性好的PCV1到PCV4四重鉴别检测方法。

发明内容

本发明为弥补PCV四种基因型毒株快速鉴别检测方法的不足，提供一种猪圆环病毒1到4型(PCV1-4)四重实时荧光PCR鉴别检测方法。本发明检测方法只需要一次检测便能判定样品是否含有PCV1,PCV2,PCV3,PCV4,或者两种以上基因型毒株共同感染。本发明方法快速、便捷、特异性强、敏感性高、可重复性好，可以进行大批量样品PCV感染情况的快速鉴别检测分析，有很好的应用前景。

本发明是通过以下技术方案实现的：

本文所列出的核苷酸序列，均由5’端向3’端方向书写。

本发明一个方面涉及四种引物对(包含八条引物序列)，其中：

PCV1引物对包含PCV1-F2020:AACCCCATAAGAGGTGGGTGTT和PCV1-R2020：TTCTACCCTCTTCCAAACCTTCCT的核苷酸序列；

PCV2引物对包含PCV2-F2020:CTGAGTCTTTTTTATCACTTCGTAATGGT和PCV2-R2020：ACTGCGTTCGAAAACAGTATATACGA的核苷酸序列；

PCV3引物对包含PCV3-F2020:CATAAATGCTCCAAAGCAGTGCT和PCV3-R2020：TCACCCAGGACAAAGCCTCTT的核苷酸序列；

PCV4引物对包含PCV4-F2020:

ATTATTAAACAGACTTTATTTGTGTCATCACTT和PCV4-R2020：ACAGGGATAATGCGTAGTGATCACT的核苷酸序列。

本发明的另一方面涉及四条探针，包含：