[发明专利]一种高表达MHC-I且具有靶向肝脏潜能的肝肿瘤细胞分泌的外泌体及其制备方法在审
| 申请号： | 202010704172.2 | 申请日： | 2020-07-21 |
| 公开（公告）号： | CN111979268A | 公开（公告）日： | 2020-11-24 |
| 发明（设计）人： | 杨木清;李济宇;陈春球;尹路 | 申请（专利权）人： | 上海市第十人民医院 |
| 主分类号： | C12N15/867 | 分类号： | C12N15/867;C12N5/10;A61K39/00;A61P35/00 |
| 代理公司： | 上海申新律师事务所 31272 | 代理人： | 郎祺 |
| 地址： | 200000 *** | 国省代码： | 上海;31 |
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| 摘要： | |||
| 搜索关键词： | 一种 表达 mhc 具有 靶向 肝脏 潜能 肿瘤 细胞 分泌 外泌体 及其 制备 方法 | ||
1.一种高表达MHC-I且具有靶向肝脏潜能的肝肿瘤细胞分泌的外泌体的制备方法，其特征在于，包括如下步骤：
步骤一，质粒的编辑：
(1)将具有抗原递呈功能的MHC-I分子插入到XPack MSCV-XP-MCS-EF1 Puro慢病毒克隆载体的多克隆位点，从而形成新质粒pLenti-MHC-I-Exo；
(2)将具有一定靶向肝脏功能的整合素αvβ5的两个亚单位αv和β5插入到所述XPackMSCV-XP-MCS-EF1Puro慢病毒克隆载体的多克隆位点，从而形成新质粒pLenti-ITGαv–Exo和pLenti-ITGβ5–Exo；
步骤二，转染：将所述质粒pLenti-MHC-I-Exo、pLenti-ITGαv–Exo和pLenti-ITGβ5–Exo分别转染HEK293细胞，培养获得相应的慢病毒颗粒Lenti-MHC-I-Exo、Lenti-ITGαv–Exo和Lenti-ITGβ5–Exo；
步骤三，感染：将所述慢病毒颗粒Lenti-MHC-I-Exo、Lenti-ITGαv–Exo和Lenti-ITGβ5–Exo混合，感染肝癌细胞18-30小时；
步骤四，外泌体的获得：感染完成后，去除感染培养液；加入含外泌体去除血清的DMEM培养基，培养从而获得了所述高表达MHC-I且具有靶向肝脏潜能的肝肿瘤细胞分泌的外泌体。
2.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，所述MHC-I分子的核苷酸序列为SEQID No.1。
3.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，所述亚单位αv和β5的核苷酸序列分别为SEQ ID No.2和SEQ ID No.3。
4.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，步骤一中所述插入到XPack MSCV-XP-MCS-EF1Puro慢病毒克隆载体的多克隆位点采用的是分子克隆的方法。
5.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，所述肝癌细胞为细胞系Hepa1-6。
6.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，步骤三中所述慢病毒颗粒Lenti-MHC-I-Exo、Lenti-ITGαv–Exo和Lenti-ITGβ5–Exo按照测得的MOI，以1：1：1的比例混合。
7.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，步骤三中所述感染的时间为24小时。
8.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，步骤四中所述培养的时间为48小时。
9.一种如权利要求1-8任一项所述制备方法制备的高表达MHC-I且具有靶向肝脏潜能的肝肿瘤细胞分泌的外泌体。
10.一种抗肿瘤疫苗，其特征在于，包括如权利要求9所述的外泌体。
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