[发明专利]一种高表达MHC-I且具有靶向肝脏潜能的肝肿瘤细胞分泌的外泌体及其制备方法

说明书

本发明公开了一种高表达MHC‑I且具有靶向肝脏潜能的肝肿瘤细胞分泌的外泌体及其制备方法。该制备方法将具有抗原递呈功能的MHC‑I分子和具有一定靶向肝脏功能的整合素αvβ5的两个亚单位αv和β5插入到XPack MSCV‑XP‑MCS‑EF1Puro慢病毒克隆载体的多克隆位点分别构建新的质粒，然后转染，再感染肝癌细胞，最后进行培养获得外泌体。该外泌体具有高表达表面MHC‑I分子的能力，还可以增加肝脏的靶向功能，从而增加肝脏组织的摄取，提高激活肝脏免疫，促进抗肝脏肿瘤的作用，可以制备成抗肿瘤疫苗，具有显著的应用价值。

技术领域

本发明涉及肿瘤免疫治疗技术领域，尤其涉及一种高表达MHC-I且具有靶向肝脏潜能的肝肿瘤细胞分泌的外泌体及其制备方法。

背景技术

肿瘤免疫是一个复杂的过程，主要包括以下7个环节：①肿瘤抗原释放；② 肿瘤抗原提呈；③启动和激活免疫细胞；④T细胞向肿瘤组织迁移；⑤肿瘤组织 T细胞浸润；⑥T细胞识别肿瘤细胞；⑦清除肿瘤细胞等。在正常状况下，免疫 系统可以识别并清除肿瘤微环境中的肿瘤细胞。病理状态下，随着肿瘤进展，肿 瘤细胞可通过各种方式抑制人体免疫系统，使其不能正常杀伤肿瘤细胞，出现免 疫逃逸。肿瘤免疫治疗就是通过重新激活人体免疫系统，恢复机体正常的抗肿瘤 免疫反应，依靠机体自身免疫机能控制、清除肿瘤细胞和肿瘤组织的一种治疗方 法。肿瘤免疫治疗可以分为主动免疫治疗、被动免疫治疗两类。主动免疫治疗是 通过作用于机体免疫系统，改善免疫功能来达到杀伤肿瘤的效果；被动(获得性) 免疫治疗则是通过直接作用于肿瘤细胞本身来杀伤肿瘤细胞。

肿瘤免疫疫苗疗法是将肿瘤细胞、肿瘤相关蛋白或多肽、肿瘤抗原的表达基因等导入患者体内，增强免疫原性，激活患者自身的免疫系统，诱导机体细胞免疫和体液免疫应答，从而达到控制或清除肿瘤的方法。外泌体是指包含了复杂 RNA和蛋白质的小膜泡(30-150nm)，现今，其特指直径在40-100nm的盘状囊泡。1983年，外泌体首次于绵羊网织红细胞中被发现，1987年Johnstone将其命名为“exosome”。多种细胞在正常及病理状态下均可分泌外泌体。其主要来源于细胞内溶酶体微粒内陷形成的多囊泡体，经多囊泡体外膜与细胞膜融合后释放到胞外基质中。肿瘤细胞分泌的外泌体，因含有所分泌肿瘤的肿瘤抗原，有望成为下一代的肿瘤疫苗。其较直接使用肿瘤细胞作为疫苗的优势有：1、外泌体本身无成瘤能力，也不能复制，相对安全；2、外泌体小，跨过各种生物屏障更为容易。

肿瘤细胞也会通过各种机制逃逸免疫识别和监视。肿瘤细胞作为有核细胞，会表达MHC-I类分子。肿瘤抗原，经MHC-I类分子递呈在细胞表面，被CD8⁺的T 细胞所识别，引起细胞毒作用，杀死肿瘤细胞。肿瘤细胞可以通过各种机制下调 MHC-I类分子，从而逃过CD8⁺的T细胞识别。我们已有的研究发现，通过上调肿瘤细胞的干扰素调节因子1(IRF-1)后分泌的外泌体(IRF-1-Exo)，具有促进抗肿瘤免疫的作用，部分是通过增加肿瘤细胞CD4⁺和CD8⁺的T细胞浸润起作用的(Yang MQ,et al.British Journal of Cancer 2018)。在该项研究中，我们发现 IRF-1-Exo的MHC-I表达是增高的。为了将这种外泌体作为肿瘤疫苗应用到临床，提高这类外泌体在肝脏肿瘤当中的作用，设计开发一种新的肿瘤细胞获得的外泌体具有重要的显示意义。

发明内容

本发明针对现有技术的不足，提供了一种高表达MHC-I且具有靶向肝脏潜能的肝肿瘤细胞分泌的外泌体及其制备方法。

为实现上述目的，本发明采用以下技术方案：

本发明的第一方面提供了一种高表达MHC-I且具有靶向肝脏潜能的肝肿瘤细胞分泌的外泌体的制备方法，该方法包括如下步骤：

步骤一，质粒的编辑：