[发明专利]通过测定外周血中性粒细胞中蛋白的表达来鉴定烟碱暴露的潜在生物标志物的方法

权利要求书

1.一种通过测定外周血中性粒细胞中蛋白的表达来鉴定烟碱暴露的潜在生物标志物的方法，其特征在于，所述方法包括以下步骤：

1) 基于条件性位置偏爱（CPP）装置建立大鼠烟碱CPP获得模型，最终获得无烟碱摄入大鼠和烟碱依赖大鼠，包括：

将大鼠随机分成实验组和对照组，每组大鼠的数量≥8只；

每2天1个给药周期，在奇数日对实验组的大鼠皮下注射烟碱溶液，给药剂量为0.6 mg/kg，对照组大鼠注射相同体积的生理盐水，注射后立即放入CPP装置的白箱中让大鼠自由活动40 min，然后放回笼中常规饲养；在偶数日对实验组和对照组的大鼠均皮下注射相同体积的生理盐水，注射后立即放入CPP装置的黑箱中让大鼠自由活动40 min，然后放回笼中常规饲养；

在开始给药后第13天，处死实验组和对照组的大鼠，获得烟碱依赖大鼠和无烟碱摄入大鼠；

2) 分别从步骤1)获得的两组大鼠中提取外周血，进一步提取外周血中性粒细胞的总蛋白，包括：

分别从步骤1)获得的两组大鼠中提取2 mL外周血，在2 h内22℃下1500 r/min离心15min获得云雾白细胞层，用与外周血等体积的无菌PBS稀释；

在15mL离心管中依次加入2mL 1.093g/mL Percoll细胞分离液、2mL 1.089g/mLPercoll细胞分离液和2mL所述PBS稀释液，在不混合的情况下，22℃下2000 r/min离心20min，吸取中性粒细胞层，6-8 mL所述无菌PBS重悬细胞后22℃下300 g离心10 min以洗脱Percoll胶粒，重复洗脱2-3次；

使细胞恢复至室温，向得到的细胞中加入100-200 uL细胞裂解液，混匀，置于冰上裂解30 min，然后在4℃下12000 g离心7 min，吸取上清即为外周血中性粒细胞的总蛋白提取液；

3) 通过Western Blotting分别检测步骤2)获得的两组总蛋白中特定蛋白的表达，包括：

检测步骤2)得到的总蛋白提取液中的蛋白浓度，蛋白浓度1000ug/mL时加入1/4体积的上样缓冲液，蛋白浓度≥1000ug/mL时加入1/3体积的上样缓冲液，煮沸5min进行蛋白变性；

冷却后以30-40 ul直接上样到浓缩胶的加样孔中，在冰浴中进行电泳，设置电压为80V，待示踪染料接近或刚跑出电泳胶的底端时即可停止电泳，切下待测蛋白分子量区域使用PVDF膜进行转膜，转膜电压为100-120 V，转膜后进行印迹膜的封闭、洗涤，分别加入待测蛋白和内参蛋白的一抗，孵育、洗涤后加入二抗，孵育、洗涤后显影；

4) 分析步骤3)检测得到的特定蛋白的表达在两组之间是否具有显著性差异，当具有显著性差异时，所述蛋白被鉴定为烟碱暴露的潜在生物标志物。

2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述大鼠为7周龄、体重200g±20g的SD雄性大鼠；

在开始建立模型之前，将大鼠分装于独立通气笼具中进行饲养，提供充足的食物和水，保持12小时的明暗交替，饲养环境温度为22℃，相对湿度为40-60%，适应环境2 d。

3. 根据权利要求1或2所述的方法，其特征在于，在开始建立模型之前，对大鼠进行为期5天的CPP基准值测试，包括：将待测试的大鼠依次单独装入CPP装置中，去掉两侧黑白箱的隔板，允许其自由活动，记录其10 min内在黑箱与白箱中自由穿梭活动的路程与时间，以大鼠在白箱中所停留的时间百分比为测试指标，根据测试结果剔除在白箱中停留时间超过测试总体时间50%和不足10%的大鼠。

4. 根据权利要求1或2所述的方法，其特征在于，所述步骤2)中，如下配制所述Percoll细胞分离液：按照9:1的体积比，向18mL Percoll原液中加入2mL灭菌的1.5mol/L氯化钠溶液配制成20mL Percoll稀释液；取6.400mL所述Percoll稀释液加入3.600mL 0.9%的无菌生理盐水配制成1.089g/mL Percoll分离液；取6.708 mL所述Percoll稀释液加入3.292mL0.9%的无菌生理盐水配制成1.093g/mL Percoll分离液。