[发明专利]一种双特异性抗体NK细胞制备方法及其细胞和应用

权利要求书

1.一种双特异性抗体NK细胞制备方法，其特征在于，包括以下步骤：

培养NK细胞；

构建CD16A/HSP70双抗慢病毒表达载体；

将CD16A/HSP70双抗慢病毒表达载体感染所述NK细胞得到CD16A/HSP70抗体的双特异性抗体NK细胞。

2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述培养NK细胞的步骤包括：

对脐带血取样病毒检测；

将检测合格的所述脐带血离心，离心后的脐带血于50-60℃水浴中灭活30-60min；

将灭活后的脐带血于-20至-10℃下冷却10-15min后离心，得到上清血浆和下部细胞液；

将所述上清血浆分为血浆1和血浆2，将所述血浆1和所述血浆2一同置于4℃冰箱保存备用；

向所述下部细胞液加入D-PBS并搅拌均匀，离心去除上清液，得到细胞层；

取10-15ml人淋巴细胞分离液加入到所述细胞层中，离心摇匀，去除上清液得到白膜细胞层；

向所述白膜细胞层加入培养液并离心，将离心后的所述白膜细胞层加入培养基得到细胞悬液，将所述细胞悬液保存备用；

取15-20mlD-PBS与试剂盒因子加入到培养瓶中，所述培养瓶于30-40℃在培养箱包被2-3h后，去除所述培养瓶中的包被液；

向去除包被液的培养瓶中加入10ml所述血浆1以及所述细胞悬液，将培养瓶记为培养瓶1。

3.根据权利要求2所述的方法，其特征在于，所述培养NK细胞的步骤还包括：

配置活化培养基和增殖培养基备用；

将培养瓶1放入37℃，5％二氧化碳饱和湿度培养箱培养，以及记为培养第一天；

培养第四天向所述培养瓶1中加入30-40ml所述活化培养基、10ml所述血浆1以及试剂盒因子，将所述培养瓶1放在37℃，5％二氧化碳饱和湿度培养箱培养；

培养第六天向所述培养瓶1中加入60-70ml所述活化培养基、10ml所述血浆1以及试剂盒因子，将所述培养瓶1放在37℃，5％二氧化碳饱和湿度培养箱培养；

培养第八天向所述培养瓶1中加入所述血浆2，得到细胞液，将所述细胞液倒入培养袋中，向所述培养袋中加入500ml所述活化培养基；将所述培养袋放入37℃，5％二氧化碳饱和湿度培养箱培养；

培养第十天将增殖培养基液500ml倒入培养袋中，将所述培养袋放在37℃，5％二氧化碳饱和湿度培养箱培养；

培养第十三天向所述培养袋补加所述增殖培养基液1000ml，将所述培养袋放在37℃，5％二氧化碳饱和湿度培养箱培养；

培养第十六天收集所述培养袋中的NK细胞悬液，离心得到NK细胞，将所述NK细胞计数封存。

4.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述构建CD16A/HSP70双抗慢病毒表达载体的步骤包括：

将IgG的前导基因，抗CD16A VL基因，第一链接Linker，抗HSP70 VH基因，第二链接Linker，抗HSP70 VL基因，第三链接Linker，抗CD16A VH基因，铰链序列基因，hIgG1 CH2基因以及hIgG1 CH3基因依次连接在一起后得到融合基因；

将所述融合基因插入到慢病毒过表达质粒载体pGreenPuro^TM的XbaI/DraIII的位点，即得到CD16A/HSP70双抗慢病毒表达载体。

5.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述将CD16A/HSP70双抗慢病毒表达载体感染所述NK细胞得到CD16A/HSP70抗体的双特异性抗体NK细胞的步骤包括：

将CD16A/HSP70双抗慢病毒表达载体和包装质粒分别进行高纯度无内毒素抽提；

将抽提之后的所述CD16A/HSP70双抗慢病毒表达载体和包装质粒共转染包装细胞；

更换所述转染包装细胞的完全培养基以及收集所述转染包装细胞的上清液；

对所述上清液进行浓缩病毒以及感染NK细胞，得到CD16A/HSP70抗体的双特异性抗体的NK细胞。

6.权利要求1所述的方法制备的双特异性抗体NK细胞。

7.权利要求1所述的方法制备的双特异性抗体NK细胞在制备治疗肝癌药品中的应用。