[发明专利]一种双特异性抗体NK细胞制备方法及其细胞和应用

说明书

本申请提供一种双特异性抗体NK细胞制备方法及其细胞和应用，所述方法包括培养NK细胞、构建CD16A/HSP70双抗慢病毒表达载体、将CD16A/HSP70双抗慢病毒表达载体感染所述NK细胞得到CD16A/HSP70抗体的双特异性抗体NK细胞。本申请制备的NK细胞的细胞特异性表型优秀以及纯度高；其中CD3‑CD56+达到97.13％，CD3‑CD56+CD16+达到93％；携带有CD16A/HSP70双抗慢病毒表达载体的NK细胞能够有效消除肝癌细胞以及抑制肝癌肿瘤体积增加的能力。

技术领域

本申请涉及细胞培养技术领域，尤其涉及一种双特异性抗体NK细胞制备方法及其细胞和应用。

背景技术

自然杀伤细胞(natural killer cell，NK)是机体重要的免疫细胞，不仅与抗肿瘤、抗病毒感染和免疫调节有关，而且在某些情况下参与超敏反应和自身免疫性疾病的发生，能够识别靶细胞、杀伤介质。自然杀伤细胞来源于骨髓淋巴样干细胞，其分化、发育依赖于骨髓及胸腺微环境，主要分布于骨髓、外周血、肝、脾、肺和淋巴结。NK细胞不同于T及B细胞，是一类无需预先致敏就能非特异性杀伤肿瘤细胞和病毒感染细胞的淋巴细胞。

NK的来源主要是靠自体和异源供给，自体NK细胞作用有限，在能够表达HLA(人类白细胞抗原)的癌细胞面前无法发挥杀伤作用，而且人体自身NK细胞数量有限，NK细胞处于不同的发育阶段，甚至同一发育阶段的不同组织中，NK细胞的表型及功能均存在很大的差异。以往的异源NK细胞主要是来源于外周血、骨髓、胚胎和胎盘，不仅难收集供者，且由于分离其他免疫细胞的成本极高。这些都限制了NK细胞在临床中上大规模运用。因此，随时可以进行配型的脐血成为了NK细胞的最新来源。

由于脐血的复杂性，获得高纯度、高活性的脐血NK一直是大规模应用的障碍。目前，脐血NK细胞培养主要是通过与饲养细胞K562共培养获得；或者是采用磁珠分选及流式分选；再或者是通过诱导干细胞分化。但是上述方法都有明显的缺点。使用饲养细胞无疑引入了外源性的细胞，增加了临床应用的风险；而磁珠分选及流式分选操作繁琐，无疑增加了细胞污染的风险，并且成本也较高；而脐带血造血干细胞分化技术尚未成熟。

国内外已经有大量的研究者进行了人NK细胞的培养和将NK细胞用于癌症治疗方面的研究，但培养得到的NK细胞存在表型较差，纯度较低等问题，不能满足实际应用的需要。

发明内容

本申请提供了一种双特异性抗体NK细胞制备方法及其细胞和应用，以解决在癌症治疗方面上NK细胞存在表型较差、纯度较低以及不能满足实际应用的需要的问题。

本申请提供一种双特异性抗体NK细胞制备方法，其特征在于，包括以下步骤：

培养NK细胞；

构建CD16A/HSP70双抗慢病毒表达载体；

将CD16A/HSP70双抗慢病毒表达载体感染所述NK细胞得到CD16A/HSP70抗体的双特异性抗体NK细胞。

可选的，所述培养NK细胞步骤包括：

对脐带血取样病毒检测；

将检测合格的所述脐带血离心，离心后的脐带血于50-60℃水浴中灭活30-60min；

将灭活后的脐带血于-20至-10℃下冷却10-15min后离心，得到上清血浆和下部细胞液；

将所述上清血浆分为血浆1和血浆2，将所述血浆1和所述血浆2一同置于4℃冰箱保存备用；

向所述下部细胞液加入D-PBS并搅拌均匀，离心去除上清液，得到细胞层；

取10-15ml人淋巴细胞分离液加入到所述细胞层中，离心摇匀，去除上清液得到白膜细胞层；