[发明专利]一种羊肚菌细胞活性氧水平的检测方法

权利要求书

1.一种羊肚菌细胞活性氧水平的检测方法，其特征在于包括以下步骤：

A)羊肚菌菌丝培养，使用装有PDA培养基的无菌平皿进行羊肚菌菌丝培养，先用打孔器在长满羊肚菌菌丝的PDA培养基边缘处打孔，并且控制孔的直径，再接种至无菌平皿中的PDA培养基的中央，恒温培养，使羊肚菌菌丝长满平皿；

B)羊肚菌菌丝处理，先将步骤A）中所述的培养基上的羊肚菌菌丝用无菌勺全部刮取至试管并且分为对照组和实验组，对照组经不同处理后继续恒温培养，而对实验组经不同处理后进行高温胁迫，并且控制高温胁迫的温度和控制高温胁迫的时间，所述的对照组经不同处理以及对实验组经不同处理各包括加外源抑制剂和不加外源抑制剂，得到对照组试管和实验组试管；

C)去除羊肚菌菌丝细胞壁，向步骤B）所述的实验组试管及对照组试管中加入溶壁酶溶液进行水浴培养并且控制溶壁酶溶液的加入量以及控制水浴培养的工艺条件，得到实验组试管酶解后的溶液以及得到对照组试管酶解后的溶液；

D)收集羊肚菌菌丝细胞原生质体，将步骤C）中实验组试管酶解后的溶液和对照组试管酶解后的溶液分别加入塞有棉花的注射器中过滤，将过滤得到的溶液分别置于离心管中，放入离心机中离心，离心结束后，吸出离心管中的上清液，羊肚菌菌丝细胞原生质体留在离心管底部，以供光学显微镜下观察原生质体制备的情况，并计数；

E)装载探针，按照1:1000体积比用无血清培养液稀释DCFH-DA探针至10 µM浓度，加入步骤D）所述的离心管内并控制羊肚菌菌丝细胞原生质体的浓度，再引入细胞培养箱孵育并且控制孵育温度以及控制孵育时间，每隔3-5min将所述离心管颠倒混匀一次，使探针和羊肚菌菌丝细胞原生质体充分接触，而后用无血清细胞培养液洗涤未进入羊肚菌菌丝细胞原生质体内的所述DCFH-DA，得到装载探针的羊肚菌菌丝细胞原生质体；

F)测定，先将由步骤E）得到的装载探针的羊肚菌菌丝细胞原生质体制成玻片并采用荧光分光光度计、荧光酶标仪、流式细胞仪或激光共聚焦显微镜检测DCF荧光，再对DCF的荧光光谱进行实时或不同时间点检测实验组和对照组荧光的强弱，接着将玻片置于荧光显微镜下观察，根据对照组和实验组细胞原生质体激发光的数量和强弱统计羊肚菌菌丝细胞活性氧水平情况。

2.根据权利要求1所述的一种羊肚菌细胞活性氧水平的检测方法，其特征在于步骤A）中所述的控制孔的直径是将孔的直径控制为4-6mm并且将孔打穿所述PDA培养基；所述恒温培养的温度为18-22℃，恒温培养的时间为72-100h。

3.根据权利要求1所述的一种羊肚菌细胞活性氧水平的检测方法，其特征在于步骤B）中所述的对照组经不同处理后继续恒温培养的时间为30-250min，温度为18-22℃，所述的控制高温胁迫的温度是将高温胁迫的温度控制为40-45℃，所述控制高温胁迫的时间是将时间控制为30-250 min。

4.根据权利要求1所述的一种羊肚菌细胞活性氧水平的检测方法，其特征在于步骤B）中所述的外源抑制剂为N-乙酰半脱氨酸或寡霉素。

5.根据权利要求1所述的一种羊肚菌细胞活性氧水平的检测方法，其特征在于步骤C）中所述的控制溶壁酶溶液的加入量是将溶壁酶溶液浸没位于所述实验组试管及对照组试管中的羊肚菌菌丝；所述溶壁酶溶液的质量百分比浓度为2%；所述控制水浴培养的工艺条件是指：水浴培养的温度为28-32℃，水浴培养的时间为220-260min。

6.根据权利要求1所述的一种羊肚菌细胞活性氧水平的检测方法，其特征在于步骤D）中所述的离心管的容积为5ml，所述离心为低温离心，该低温离心的温度为3.5-4.5℃，离心机的转速为750-850rpm，离心时间为9-11 min。

7.根据权利要求1所述的一种羊肚菌细胞活性氧水平的检测方法，其特征在于步骤E）中所述的控制羊肚菌菌丝细胞原生质体的浓度是将浓度控制为1×10⁶-2×10⁷ /ml；所述的控制孵育温度及孵育时间是将孵育温度及孵育时间分别控制为35-39℃以及18-22min。