[发明专利]一种羊肚菌细胞活性氧水平的检测方法

说明书

一种羊肚菌细胞活性氧水平的检测方法，属于食用菌菌丝细胞检测技术领域。步骤：羊肚菌菌丝培养；羊肚菌菌丝处理；去除羊肚菌菌丝细胞壁；收集羊肚菌菌丝细胞原生质体；装载探针；测定，将得到的装载探针的羊肚菌菌丝细胞原生质体制成玻片并采用荧光分光光度计、荧光酶标仪、流式细胞仪或激光共聚焦显微镜检测DCF荧光，再对DCF的荧光光谱进行实时或不同时间点检测实验组和对照组荧光的强弱，接着将玻片置于荧光显微镜下观察，根据对照组和实验组细胞原生质体激发光的数量和强弱统计羊肚菌菌丝细胞活性氧水平情况。能通过活性氧水平检测对羊肚菌的生长、发育、繁殖以及栽培之类的环节中的状况进行预判。

技术领域

本发明属于食用菌菌丝细胞检测技术领域，具体涉及一种羊肚菌细胞活性氧水平的检测方法。

背景技术

羊肚菌（Morchella spp.）隶属于子囊菌门，广泛分布于全球各地并且种类较多，据报道全世界有60余种，中国约占30种，主要分布在云南、甘肃、四川、青海和江苏等地。羊肚菌味道鲜美，香味独特，营养丰富，保健功能齐全，受到全世界人民的青睐。从功效而论，羊肚菌还有补肾、提神、防癌的作用，所以羊肚菌与虫草均属于高级营养滋补品，是世界上最为名贵的食用菌，需求量日益增长，羊肚菌人工栽培技术也随之快速发展。

现有的人工栽培技术中多采用大棚种植羊肚菌，容易造成高温和缺氧的情况，导致羊肚菌出菇品质差异大，产量和品质档次低，甚至导致绝产。目前，温度胁迫对羊肚菌生长发育影响已有研究，而高温胁迫引发细胞凋亡的研究在羊肚菌中尚未见报道。

如业界所知，在凋亡的早期细胞都会出现ROS（活性氧簇）的迸发现象，而ROS累积可以通过氧化敏感的化学物质来检测。当ROS大量存在时，这些化学物质可以改变吸光度或发现荧光，且荧光强度与细胞内ROS含量成正比。

活性氧是体内一类氧的单电子还原产物，是电子在未能传递到末端氧化酶之前漏出呼吸链并消耗大约2%的氧生成的，包括氧的电子还原产物超氧阴离子、电子还原产物过氧化氢、电子还原产物羟基自由基以及一氧化氮等，它们来源于叶绿体、线粒体和过氧化物酶体等氧化代谢活动较为旺盛的细胞器，并随即被胞内抗氧化防卸组分清除。

由于ROS组分高度活跃，半衰期很短，在细胞中的产生和清除同时进行，大量ROS信号往往在数秒甚至数毫秒内便被传送到下游细胞器，因而必须通过高时空分辩而探索的分析手段才能精确地检测ROS的动态变化，从而探索ROS在生产调控中的作用。最初对ROS的检测多采用分光光度法（测定被测物质在特定波长处或一定波长范围内光的吸收度）、电子自旋共振捕获法（也称“ESR捕获法”）和细胞内荧光探针标记法（可参见中国专利公布号CN108069967A提供的“一种用于细胞内蛋白标记的荧光探针及其合成方法和应用”），等等。

在迄今为止公开的中外专利和非专利文献中均未见与羊肚菌菌丝细胞活性氧水平检测相关的技术信息，然而经本申请人所作的实验表明：对羊肚菌细胞活性氧水平的检测能对羊肚菌菌丝细胞凋亡情况进行预判。下面将要介绍的技术方案便是在这种背景下产生的。

发明内容

本发明的任务在于提供一种羊肚菌细胞活性氧水平的检测方法，该方法能有效地检测羊肚菌菌丝细胞活性氧水平，并对菌丝的细胞凋亡情况进行预判而得以帮助了解羊肚菌的生长、发育、繁殖以及栽培诸环节中的状况。

本发明的任务是这样来完成的，一种羊肚菌细胞活性氧水平的检测方法，包括以下步骤：

A）羊肚菌菌丝培养，使用装有PDA培养基（马铃薯葡萄糖琼脂培养基）的无菌平皿进行羊肚菌菌丝培养，先用打孔器在长满羊肚菌菌丝的PDA培养基边缘处打孔，并且控制孔的直径，再接种至无菌平皿中的PDA培养基的中央，恒温培养，使羊肚菌菌丝长满平皿；