[发明专利]检测基因PEAR1 SNP位点的引物、方法和试剂盒

说明书

本发明提供利用高分辨率溶解曲线技术检测PEAR1基因SNP位点rs12566888的引物、方法和试剂盒，检测PEAR1基因rs12566888位点多态性，在外周血DNA样本中采用直接测序法筛选出标准品(GG基因型、GT基因型及TT基因型)并对HRM检测结果采用直接测序法进行验证，可用于辅助临床上阿司匹林用药，有助于预防阿司匹林用药期间的各种不良反应的发生。

技术领域

本发明属于生命科学和生物技术领域，涉及一种临床检验用途的基因多态性检测方法和试剂盒及其所使用的引物，通过采用HRM技术，检测患者体内阿司匹林用药相关PEAR1基因的SNP位点rs12566888。

背景技术

阿司匹林是应用较为广泛的药物，除具有解热镇痛和抗炎作用外，还具有抗血小板作用，其作用机制为直接并不可逆地抑制环氧化酶(COX-1和COX-2)，减少前列腺素的合成，抑制血小板合成血栓素A2(TXA2)，从而抑制血小板聚集。阿司匹林也可抑制低浓度胶原、凝血酶、抗原-抗体复合物等所致的血小板聚集和释放反应及自发性聚集，由此发挥预防血栓的作用。临床研究证实，阿司匹林在降低高危型心源性猝死、脑卒中、心肌梗死等患者病症危险性方面具有显著的效果。但仍存在部分患者出现对阿司匹林疗效的不敏感---阿司匹林抵抗。阿司匹林抵抗通常是指阿司匹林不能发挥预期的生物作用或者不能预防栓塞性疾病。这一现象广泛存在于正常健康机体、心脑血管疾病患者以及外周血管病患者中，发生率高达8％～45％。

国内外临床研究表明，阿司匹林抵抗和不良反应与患者基因多态性相关。遗传因素导致的药物反应个体化差异，可以使用基因检测提前发现，判断个体的不良反应风险情况，从而采取个体化的精准用药治疗。

目前科学研究表明阿司匹林抵抗相关基因有：GPIIIaPLA1\PLA2、PEAR1、PTGS1、PAI-1、GP1BA、LTC4S、GSTP1、P2Y1等。

PEAR1(platelet endothelial aggregation receptor 1)基因是近年发现的与血小板聚集密切相关的基因，位于1号染色体，在血小板和内皮细胞均有高度的表达，其编码Ⅰ型膜蛋白，在胞外有多个酪氨酸和脯氨酸残基，在胞内有5个脯氨酸残基和1个NPXY922区域，均为磷酸化酪氨酸的结合位点。该基因可通过调控PI3K/PTEN通路，影响血小板的功能，为非Cox依赖性途径影响血小板聚集。PEAR1基因rs12566888(IVS1-4663G＞T)，是位于PEAR1基因内含子1上的一处突变。Andrew等人的研究发现，PEAR1基因rs12566888的T等位基因可以引起血小板低聚集。Sokol等人的研究表明，PEAR1的单核苷酸多态性rs12566888在有流产史的黏血症患者中有更高的突变率，且PEAR1c.-9-4663G＞T的T等位基因对胎儿流产有保护作用。

目前单核苷酸多态性(SNP)检测常用的技术有限制性片段长度多态性分析(RFLP)、等位基因特异性PCR(AS-PCR)及直接测序法等。RFLP对设备要求不高，但操作过程复杂，容易产生假阴性错误；AS-PCR对引物设计及PCR反应条件要求较高，容易出现假阳性错误；直接测序法尽管结果准确，但是试验过程繁琐，成本较高。

发明内容

鉴于现有技术中存在的不足，本发明设计了检测目的基因SNP位点用引物序列，采用高分辨率熔解曲线分析技术(high resolution melting，HRM)检测PEAR1基因rs12566888位点多态性。在外周血DNA样本中采用直接测序法筛选出标准品(GG基因型、GT基因型及TT基因型)并对HRM检测结果采用直接测序法进行验证。本发明通过调整PCR反应体系及反应条件，使扩增效率达到最佳。

本发明提供利用高分辨率溶解曲线技术检测PEAR1基因SNP位点rs12566888的引物，所述引物的碱基序列为：

PEAR1-HRM-F:CACAGCTTGTAAGACAGAGATAGG；