[发明专利]一种T细胞模型及其在体外人源PD-1抗体药效评价中的应用

权利要求书

1.一种T细胞模型，其特征在于，由以下步骤制备而成：

(1) 对huGEMM PD-1小鼠进行MC-38肿瘤细胞接种，诱导MC-38抗原特异性效应T细胞和记忆T细胞的产生；

(2) MC-38 抗原特异性多肽的合成；

(3) 将步骤（2）合成的MC-38 抗原特异性多肽刺激步骤（1）获得的MC-38抗原特异性效应T细胞和记忆T细胞，富集表位特异性T细胞，在体外扩增并建立细胞库，建立所述T细胞模型。

2.根据权利要求1所述的一种T细胞模型，其特征在于，所述步骤（1）的具体步骤为：

将处于对数生长期的MC-38结肠癌肿瘤细胞接种到C57/BL6背景的huGEMMPD-1小鼠中，接种量为1x10⁶细胞/只；肿瘤接种5-30天后，选择肿瘤体积在50-150mm³的小鼠，进行脾脏细胞的无菌分离，冻存在含有10%DMSO的血清冻存液中，液氮保存。

3.根据权利要求1所述的一种T细胞模型，其特征在于，所述步骤（2）的MC-38抗原特异性多肽选自Adpgk和/或 Rpl18。

4.根据权利要求3所述的一种T细胞模型，其特征在于，所述多肽Adpgk的氨基酸序列为SEQ ID NO：1；所述多肽Rpl18的氨基酸序列为SEQ ID NO：2。

5.根据权利要求3所述的一种T细胞模型，其特征在于，所述步骤（3）的具体步骤为：

a.将冻存的hGEMMPD-1 MC-38荷瘤小鼠的脾脏细胞快速解冻复苏，以1 x 10⁶-5 x 10⁶/ml的细胞密度培养，同时加入 0.5-1.5 ug/mL Adpgk或Rpl18,再加入0.5-1.5ug/ml 的anti-mCD28和1-3ng/mL rm-IL2，5% CO₂，37℃培养箱培养3天；

b.第三天，计数细胞，按照1-2 x 10⁶/ml重悬细胞，重新铺板并加入新鲜的含有1-3ng/ml rm-IL2和5-15ng/ml rm-IL7的培养基，继续培养；

c.第六天，继续按照第三天的操作，计数细胞，按照1-2 x 10⁶/ml重悬细胞，重新铺板并加入新鲜的含有1-3ng/ml rm-IL2和5-15ng/ml rm-IL7的培养基，继续培养;

d.第九天，计数细胞，重悬在含有25-75ng/ml rm-IL2的新鲜培养基中，细胞浓度为1-2x 10⁶/ml；

e.第十一天，离心收集细胞，用T细胞激活的cocktail刺激2-6h，流式检测Live/Dead、CD8、PD-1、IFN-r，并将剩余的细胞冻存备用，得Adpgk或者Rpl18表位特异的T细胞库，即所述T细胞模型。

6.如权利要求3所述的一种T细胞模型在体外人源PD-1抗体药效评价中的应用，其特征在于，包括以下步骤：

a)用0.5-1.5ug/ml的Adpgk或Rpl18体外刺激的MC-38肿瘤细胞，37℃培养箱中孵育30分钟，用PBS洗掉未结合的多肽;

b) 用2.5uM CFSE标记处于对数生长期的MC-38肿瘤细胞;

c) 将Adpgk或Rpl18刺激后的MC-38肿瘤细胞和Adpgk或者Rpl18表位特异的T细胞共培养，所述T细胞和肿瘤细胞的数量比为1:1-5:1；在共培养体系中加入待评价的PD-1抗体药物；

d) 共培养24-48小时，收集细胞上清检测IFN-r的分泌，收集细胞沉淀，流式检测L/D、CD45、CFSE和来检测CFSE+的细胞中死细胞的比例，用来直接检测加入PD-1抗体药物后表位特异性T细胞杀伤肿瘤细胞的能力。

7.根据权利要求6所述的一种T细胞模型在体外人源PD-1抗体药效评价中的应用，其特征在于，所述MC-38肿瘤细胞为携带肿瘤特异性抗原并且同时过表达人的PD-L1分子的MC-38细胞：MC-38-hPD-L1。