[发明专利]一种改良柑橘的sgRNA及其应用和使用方法

说明书

本发明涉及植物基因工程技术领域。本发明提供了一种改良柑橘的sgRNA及其应用和使用方法，所述sgRNA的核苷酸序列如SEQ ID No.1、SEQ ID No.2、SEQ ID No.3、SEQ ID No.4、SEQ ID No.5、SEQ ID No.6、SEQ ID No.7、SEQ ID No.8、SEQ ID No.9或SEQ ID No.10。本发明的sgRNA分值高、脱靶效率低，指导Cas9酶切靶标序列效率高。可以对CsPP2B15基因进行修饰和表达调控，其突变的CsPP2B15基因显著增加了转基因柑橘对黄龙病的抗性，黄龙病症状明显减缓，病原菌含量显著下降。

技术领域

本发明涉及植物基因工程技术领域，尤其涉及一种改良柑橘的sgRNA及其应用和使用方法。

背景技术

柑橘黄龙病是一种系统性的病害，所造成的危害是毁灭性的，并且病菌几乎能侵染所有柑橘品种。据统计，柑桔黄龙病已在我国19省区蔓延，受害面积占柑桔总栽培面积的80％以上，产量占总产量的85％左右。柑桔黄龙病病原为韧皮部杆菌属革兰氏阴性细菌，包括亚洲种、非洲种和南美洲种。目前，柑橘生产上尚无从根本上解决柑橘黄龙病病害的技术措施，只能采取销毁发病植株或发病果园等一系列破坏性措施，来彻底清除柑橘黄龙病。对果农来说，经济损失非常严重。

由于柑橘黄龙病问题采用传统手段无法完全解决，因此需要寻找更好的方法。利用抗性种质资源，结合植物基因工程手段挖掘抗病基因，并培育抗病品种增强柑橘对黄龙病的抗性，是最为经济，同时也是从根本上解决这一难题的最为有效的途径。

发明内容

本发明的目的在于提供一种改良柑橘的sgRNA及其应用和使用方法，从根本上解决黄龙病的威胁，彻底清除柑橘黄龙病。

为了实现上述发明目的，本发明提供以下技术方案：

本发明提供了一种改良柑橘的sgRNA，其核苷酸序列如SEQ ID No.1、SEQ IDNo.2、SEQ ID No.3、SEQ ID No.4、SEQ ID No.5、SEQ ID No.6、SEQ ID No.7、SEQ ID No.8、SEQ ID No.9或SEQ ID No.10。

作为优选，所述sgRNA序列在改良柑橘时作用于柑橘CsPP2B15基因。

本申请还提供了一种改良柑橘的sgRNA在改良柑橘黄龙病抗性中的应用。

本申请还提供了一种改良柑橘的sgRNA的使用方法，包括如下步骤：

(1)利用sgRNA序列构建CRISPR/Cas9编辑用表达载体；

(2)将步骤(1)构建的表达载体导入到柑橘中，筛选出转基因植株；

(3)从步骤(2)获得的转基因植株中筛选出CsPP2B15突变体植株；

(4)从步骤(3)获得的CsPP2B15突变体植株中筛选出柑橘黄龙病抗性植株。

作为优选，所述步骤(1)中构建载体时所用的载体为pCas9-CsPP2B15sgRNA。

作为优选，所述步骤(1)中构建载体时所用的酶为BamHI/SalI酶。

作为优选，所述导入的方法为根癌农杆菌介导法和电击转化法。

作为优选，所述步骤(2)中所述的转基因柑橘植株筛选方法为抗性筛选、GUS组织化学染色和PCR验证。

作为优选，所述步骤(3)中筛选突变体植株的方法为Sanger测序法和重测序技术。

作为优选，所述步骤(4)中黄龙病抗性植株筛选方法为嫁接传毒、温室症状和切片观察、定量PCR检测。