[发明专利]一种多孔阳极氧化铝-Cas/dCas家族蛋白复合传感膜片及其制备方法及应用方法

说明书

本发明适用于生物技术领域，提供了一种多孔阳极氧化铝‑Cas/dCas家族蛋白复合传感膜片及其制备方法及应用方法，该复合传感膜片将Cas/dCas家族蛋白组装至多孔阳极氧化铝膜片，使该膜片能够结合具有特定核酸序列的双链DNA，并采用电化学设备对膜片两侧通过的钾离子进行测定，电信号改变能够反映对膜片表面对特定核酸序列的结合能力，可用于与核酸鉴定相关的诸多领域，具有广阔的市场前景。

技术领域

本发明属于生物技术领域，尤其涉及一种多孔阳极氧化铝-Cas/dCas家族蛋白复合传感膜片及其制备方法及应用方法。

背景技术

随着科技的迅速发展，纳米材料已经在各个领域中展现出其特有的价值。随着近两年微纳加工技术不断进步和成熟，纳米材料在科研和生活中扮演的角色越来越重要。纳米量级的材料具有很强的特殊性，能够在光学、生物学、电磁学以及多交叉学科中有很广泛的应用。

多孔阳极氧化铝(Porous Anodic Alumina，PAA)，由于具有高度的纵横比尺寸、有序可控、硬度大、耐高温等特点，因而可被用作纳米复合材料的填充模板或者其它纳米材料的生长基底，并且还可广泛应用于生物分子检测、生化传感器等领域中。

但是，现有的多孔阳极氧化铝由于其结构等方面的因素而不能与目的序列稳定地结合，因此其在生物分子检测，尤其是在特定核酸序列的检测应用的灵敏度差，检测结果不准确。

目前，针对特定核酸序列的分析和鉴定方法主要是用于生命科学、临床医学和刑事鉴定等多个方面，并在其中已经起到了不可替代的重要作用。当下针对特定核酸序列的分析和鉴定方法主要是核酸测序、PCR(polymerase chain reaction，聚合酶链式反应)、等温扩增、CRISPR(Clustered regularly interspaced short palindromic repeats)检测技术等几类，每种技术各有优缺点。需要指出的是，单独使用CRISPR检测技术通常达不到临床检验的灵敏度，因此需要结合扩增技术来提高灵敏度。CRISPR检测技术理论上可进一步提高单独使用扩增方法的灵敏度和特异性。CRISPR相关蛋白Cas/dCas蛋白家族(CRISPRassociated proteins family)可结合其他方法进行效率更高的检测。

发明内容

本发明实施例提供一种多孔阳极氧化铝-Cas/dCas家族蛋白复合传感膜片，旨在解决现有的CRISPR检测方法的灵敏度和特异性不高的问题。

本发明实施例是这样实现的，一种多孔阳极氧化铝-Cas/dCas家族蛋白复合传感膜片，多孔阳极氧化铝膜片的表面或孔道内壁连接有Cas/dCas家族蛋白。

本发明实施例还提供了一种多孔阳极氧化铝-Cas/dCas家族蛋白复合传感膜片的制备方法，包括：(1)对多孔阳极氧化铝膜片进行清洗预处理，得预处理后的多孔阳极氧化铝膜片；(2)对所述预处理后的多孔阳极氧化铝膜片的阻挡面层依次进行羟基化表面修饰处理、氨基化表面修饰处理和戊二醛组装表面修饰处理，得到改性多孔阳极氧化铝膜片。

本发明实施例还提供了一种多孔阳极氧化铝-Cas/dCas家族蛋白复合传感膜片，所述多孔阳极氧化铝-Cas/dCas家族蛋白复合传感膜片由上述的多孔阳极氧化铝-Cas/dCas家族蛋白复合传感膜片的制备方法制备得到。

本发明实施例还提供了一种多孔阳极氧化铝-Cas/dCas家族蛋白复合传感膜片在检测特定核酸序列中的应用方法，包括如下步骤：

(1)将表面组装有Cas家族蛋白或dCas家族蛋白的改性多孔阳极氧化铝膜片放入检测容器中，并加入电极缓冲液覆盖所述改性多孔阳极氧化铝膜片的两侧；

(2)向所述检测容器加入根据目的基因设计得到的单链引导核糖核酸RNA，使所述改性多孔阳极氧化铝膜片上的Cas蛋白或dCas家族蛋白与所述单链引导RNA进行结合；