[发明专利]用于改进细胞核/细胞质RNA分离效率的RNA提取方法及应用

说明书

本发明提供了一种用于改进细胞核/细胞质RNA分离效率的RNA提取方法及应用，涉及分子生物技术领域，本发明提供的用于改进细胞核/细胞质RNA分离效率的RNA提取方法，在进行细胞裂解后进行细胞计数，当死亡细胞占总细胞量的60‑80％时停止裂解，然后再进行后续的RNA提取操作。该方法通过统计死亡细胞数量占比，能够掌握细胞裂解程度，从而有效防止细胞裂解过度或裂解不足，避免细胞膜裂解过度导致核膜裂解，胞质RNA受到胞核RNA的污染的问题，或者由于裂解不足而使得提取到的胞质RNA的量低于实际细胞质中RNA的含量的问题，提高胞质/胞核的分离效率。

技术领域

本发明涉及分子生物技术领域，尤其是涉及用于改进细胞核/细胞质RNA分离效率的RNA提取方法及应用。

背景技术

功能基因组学领域对基因表达分析最感兴趣。现在人类基因组已经完成测序，非常需要鉴定涉及疾病的基因和突变。这些基因可能是上调或下调基因，或者是多态性基因。用于分析这些基因的许多方法包括分离RNA。

目前常规RNA分离方法是由细胞分离总RNA。该方式分离的RNA包括胞质的RNA和胞核的RNA，通过逆转录之后用实时荧光定量PCR的方法进行定量和分析。这些方法中所使用的原料一直是细胞或组织样品的总RNA或poly(A)+RNA。一方面这种方法无法满足分别对定位于细胞核/细胞质的非编码RNA的研究。同时，使用全细胞的总RNA时，结果是转录产物以及胞质降解产物的混合物。

其中，最传统的细胞核/质分离提取RNA方法(蔗糖密度梯度离心法)分两步：(1)差速离心分离细胞器：在密度均一的介质(如蔗糖)中由低速到高速逐级离心，用于分离不同大小的细胞和细胞器。在差速离心中细胞器沉降的顺序依次为：核、线粒体、溶酶体与过氧化物酶体、内质网与高基体、最后为核蛋白体。由于各种细胞器在大小和密度上相互重叠，而且某些慢沉降颗粒常常被快沉降颗粒裹到沉淀块中，一般重复2～3次效果会好一些。差速离心只用于分离大小悬殊的细胞，更多用于分离细胞器。通过差速离心可将细胞器初步分离，常需进一步通过密度梯离心再行分离纯化。速度逐渐提高，样品按大小先后沉淀。(2)核酸的分离纯化。上述方法存在操作繁琐、耗时较长、对离心机等硬件要求高的缺点，并且，梯度离心分离得到的各组分纯度并不高。

此外，目前市面上已经有的一些商品化的细胞核/质分离试剂盒，例如Millipore及BioVision等公司的核/质提取试剂盒，其操作过程有一步是离心之后吸取上清(胞质成分)，沉淀为胞核成分，这一过程有可能因为没有吸取干净上清导致胞核中有胞质成的残留导致分离彻底。同时，第一步裂解过程也可能因为不同细胞的裂解时间不够或者裂解过度导致胞质/胞核的分离不纯，导致分离效率不高。

有鉴于此，特提出本发明。

发明内容

本发明的主要目的在于提供一种用于改进细胞核/细胞质RNA分离效率的RNA提取方法，以至少缓解了现有技术中存在的技术问题之一。

本发明提供了一种用于改进细胞核/细胞质RNA分离效率的RNA提取方法，所述提取方法包括：向细胞中加入胞膜裂解液后进行细胞计数，当死亡细胞占总细胞量的60-80％时停止裂解，将裂解产物进行核质分离并分别提取RNA。

进一步的，加入裂解液后每3-5分钟进行一次细胞计数，至死亡细胞占总细胞量的60-80％。

进一步的，通过台盼蓝染色法进行细胞计数。

进一步的，将裂解产物通过过滤的方式，实现核质成分分离；

优选地，将裂解产物通过超细玻璃纤维膜过滤。

进一步的，将裂解产物加入含有硅胶膜或超细玻璃纤维过滤柱的离心管中进行过滤，实现核质成分分离。

进一步的，过滤后还包括清洗的步骤。

进一步的，通过离心的方式进行清洗；