[发明专利]一种无血清无饲养层的胚胎干细胞或多能干细胞培养基及其应用

说明书

本发明涉及一种无血清无饲养层的胚胎干细胞或多能干细胞培养基及其应用，所述无血清无饲养层的胚胎干细胞或多能干细胞培养基包括基础培养基和添加剂，所述添加剂包括肝素钠、哌啶酸、γ‑氨基丁酸和锂离子盐。其是一种完全无异源(Xeno‑free)的培养体系，不会带来外源污染；培养基中的bFGF浓度可以被显著地降低，因而使培养基的制备成本显著降低，同时有效减少了bFGF的聚集现象，稳定性提高，使培养的胚胎干细胞或多能干细胞的质量维持稳定，能够长时间维持胚胎干细胞或多能干细胞的未分化状态和多能性；另外，哌啶酸、γ‑氨基丁酸和锂离子盐三种物质在促进胚胎干细胞或多能干细胞的生存、增殖、维持连续传代中具有难以预料的协同增效作用。

技术领域

本发明属于细胞培养技术领域，涉及一种胚胎干细胞或多能干细胞培养基及其应用，具体涉及一种无血清无饲养层的胚胎干细胞或多能干细胞培养基及其应用，尤其涉及一种稳定的、低蛋白含量的胚胎干细胞或多能干细胞培养基及其应用。

背景技术

人胚胎干细胞(Human embryonic stem cells，hESCs)是来源于体外受精的囊胚内细胞团的多能性细胞。hESCs具有向外胚层、内胚层和中胚层分化的能力，如心肌细胞、神经元、胶质细胞、肝细胞、胰岛细胞、软骨细胞、骨骼肌细胞、脂肪细胞和内皮细胞等。

传统的hESCs培养方法需要将hESCs置于丝裂霉素处理的饲养层细胞上(如胚胎成纤维细胞，MEFs)，这种方法虽然可以维持hESCs的生长和增殖，但是面临着饲养层细胞制备过程繁琐、不易分离饲养层细胞等问题。此外，饲养层细胞的质量也会对hESCs的生长造成影响，导致hESCs质量不一，批次性差异大，而且饲养层细胞也可能是动物病原体和支原体污染的来源。

为了进一步提高hESCs体外培养时的质量，需要在不影响hESCs质量和数量的前提下开发完全无异源的培养体系。目前已开发了无需饲养层细胞的培养方案，即采用来自小鼠肉瘤细胞的基底胶或者玻连蛋白包被培养板，已经证明可以用于hESCs的稳定培养和连续传代。hESCs具有广阔的工程应用前景，可以控制添加小分子、化合物和生长因子调控hESCs的生长，为下游的药物研究、疾病机理研究提供质量均一的种子细胞。

目前，现有技术已经开发了各具特色的无血清、无饲养层的hESCs培养基，虽然市面上这些无血清培养基可以在一定程度上克服血清和饲养层细胞引发的问题，但是大多存在蛋白含量高、生产成本高、细胞易出现分化等问题。尤其是细胞因子bFGF(碱性成纤维生长因子)，需要达到100ng/mL的高浓度才可以维持细胞的正常生长及多能性，bFGF正是造成无血清培养基生产成本居高不下的主要原因。

bFGF是已知的FGF家族的23个成员之一，该家族蛋白在促进细胞增殖和分化、产前发育、产后生长和各种组织再生过程中起着重要作用。bFGF信号通过FGFR 1b、FGFR 1c、FGFR 2c、FGFR 3c和FGFR4发挥作用。bFGF通过与细胞表面的特定酪氨酸激酶受体(RTK)结合，激活其靶细胞。在目前的研究中，FGFR信号可能在人胚胎干细胞的维持中发挥重要作用。然而，bFGF信号是剂量依赖性的，高水平的bFGF可能需要满足特定的信号阈值或防止蛋白降解等抑制作用。同时bFGF在37℃时会发生聚集，从而降低了维持多能性的生物利用度。因此，bFGF作为一种重要的信号因子，其高浓度增加了无血清培养基的成本，不稳定性又会影响hESCs的质量，从事hESCs研究的科研人员不得不面临着成本和质量的两难选择。

发明内容

针对现有技术的不足，本发明的目的在于提供一种胚胎干细胞或多能干细胞培养基及其应用，具体提供一种无血清无饲养层的胚胎干细胞或多能干细胞培养基及其应用，尤其提供一种稳定的、低蛋白含量的胚胎干细胞或多能干细胞培养基及其应用。

为达到此发明目的，本发明采用以下技术方案：

一方面，本发明提供一种无血清无饲养层的胚胎干细胞或多能干细胞培养基，所述无血清无饲养层的胚胎干细胞或多能干细胞培养基包括基础培养基和添加剂，所述添加剂包括肝素钠、哌啶酸、γ-氨基丁酸和锂离子盐。